Modulación de la proliferación y apoptosis de células epiteliales intestinales por Lactobacillus gasseri SF1183

Apr 05, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20248 (2022) Citar este artículo

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La microbiota intestinal ejerce una variedad de efectos positivos sobre la homeostasis intestinal, incluida la producción de moléculas beneficiosas, el control de la integridad de la barrera epitelial y la regulación del equilibrio entre la proliferación y la muerte celular del huésped. Las interacciones entre las bacterias comensales y las células intestinales todavía están poco investigadas y, por lo tanto, es de suma importancia abordar tales interacciones a nivel molecular y celular. Presentamos un análisis in vitro de los efectos de las moléculas secretadas por Lactobacillus gasseri SF1183 en células HCT116, seleccionadas como modelo de células epiteliales intestinales. SF1183 es ​​una cepa de L. gasseri aislada de una biopsia ileal de un voluntario humano sano, capaz de prevenir los síntomas de la colitis in vivo. Ampliando los hallazgos anteriores, mostramos que las moléculas bioactivas secretadas por SF1183 reducen la proliferación de las células HCT116 de manera reversible, lo que determina una variación en los marcadores del ciclo celular (p21WAF, p53, ciclina D1) y da como resultado la protección de las células HCT116 de las células inducidas por TNF-alfa. apoptosis, un efecto potencialmente relevante para la protección de la integridad de la barrera epitelial y la reconstitución de la homeostasis tisular. Consistentemente, las moléculas secretadas de SF1183 aumentan el reclutamiento de ocludina, un componente principal de TJ, en los contactos célula-célula, lo que sugiere un refuerzo de la función de barrera.

La microbiota intestinal coevolucionó con su huésped animal formando una relación simbiótica y contribuyendo a la salud metabólica del huésped. La distribución relativa de las bacterias intestinales es única para un individuo y cambia transitoriamente según la dieta, la edad, el ejercicio corporal, el uso de medicamentos y la genética del huésped, lo que dificulta definir una microbiota normal o saludable. Sin embargo, una gran diversidad de taxones, una gran riqueza y núcleos funcionales estables de microbiota caracterizan a las comunidades microbianas intestinales sanas1. Las alteraciones drásticas de dicha composición microbiana (disbiosis) se han asociado a la patogenia de diversos trastornos metabólicos y enfermedades inflamatorias intestinales, incluidas las inflamaciones del colon (CU, Colitis Ulcerosa, EC, Enfermedad de Chron), generalmente denominadas Enfermedades Inflamatorias Intestinales (EII). Las EII se caracterizan por una producción anormal de citocinas inflamatorias (TNF-α, factor de necrosis tumoral alfa, IFN-γ interferón gamma) por parte de las células huésped y la alteración de la integridad epitelial en parte debido a una mayor apoptosis. Para equilibrar estas condiciones, se han propuesto y probado una serie de estrategias de intervención dirigidas a la microbiota en modelos animales y, en algunos casos, en ensayos con humanos. Estos incluyen la administración oral de (1) prebióticos, oligosacáridos no digeribles (por ejemplo, inulina y oligofructosa) que, una vez fermentados por algunos miembros de la microbiota, provocan una mejora de las funciones de barrera intestinal, (2) probióticos, bacterias vivas que, colonizando el intestino ejerce un efecto beneficioso para la salud (3) simbióticos, una combinación de prebióticos y varias cepas de probióticos; y (4) postbióticos, probióticos pasteurizados o partes de cepas microbianas1.

Actualmente, el uso oral de probióticos está muy bien aceptado debido a la capacidad de algunas bacterias para influir en la expresión de citocinas, reducir la inflamación y proteger la integridad de la barrera intestinal2,3,4,5,6. El uso de probióticos se originó a partir de alimentos tradicionales que contenían bacterias vivas, comunes en muchas culturas y considerados con efectos beneficiosos para la salud. Ejemplos bien conocidos en este contexto son las bacterias del ácido láctico, presentes en una variedad de alimentos fermentados tradicionales7 y los formadores de esporas del género Bacillus que se encuentran en Natto, un alimento saludable tradicional japonés a base de soja fermentada con B. subtilis var. natto y en alimentos fermentados similares utilizados tradicionalmente en varios países8. Varias especies de los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus y Saccharomyces se han utilizado durante mucho tiempo como probióticos comerciales8,9. Además, se han propuesto otras bacterias intestinales como probióticos de próxima generación, como Faecalibacterium prausnitzii10 y Akkermansia muciniphila11.

Los mecanismos moleculares que controlan la interacción entre las células intestinales y las bacterias se han estudiado in vitro en algunos casos. Los ejemplos son L. casei Shirota que tiene efectos inmunomoduladores al inducir la producción de interleucina-12 (IL-12); L. fermentum NCIMB 5221 que tiene un efecto antiproliferativo y modula la hiperinsulinemia, la resistencia a la insulina, la hipercolesterolemia y la hipertrigliceridemia; Saccharomyces cerevisiae var.boulardii que tiene efectos antiinflamatorios y antibacterianos al aumentar la secreción de inmunoglobulina A (IgA) y mantener la integridad de la barrera epitelial12. A menudo, se ha demostrado que los autoinductores de detección de quórum, moléculas de comunicación liberadas por bacterias a altas densidades, modulan las respuestas del huésped, ya sea directamente o mediante la regulación de genes bacterianos. Los ejemplos en este contexto son los péptidos de detección de quórum de varias especies de Bacillus que son captados por las células intestinales y contribuyen a la homeostasis de las células eucariotas activando las vías de supervivencia (proteína quinasa activada por mitógeno p38 (MAPK) y proteína quinasa B)13,14. En algunos casos, no se han identificado los efectores bacterianos secretados: se descubrió que las moléculas secretadas por L. reuteri potencian la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral (TNFα) en células derivadas de leucemia mieloide mediante la supresión de la activación del factor nuclear-kB (NF-kB) al inhibir la degradación de IkBa, regular a la baja los productos génicos dependientes del factor nuclear kB (NF-kB) y promover la apoptosis al mejorar las actividades de MAPK, incluida la quinasa N-terminal c-Jun y p38 MAPK15.

En este contexto, nuestro estudio investiga los efectos in vitro de la/s molécula/s bioactiva/s producida/s y secretada/s por una cepa de L. gasseri sobre células colorrectales HCT116, tanto a nivel molecular como celular. L. gasseri es una de las principales especies de Lactobacillus homofermentativas del intestino humano y la cepa SF1183 se aisló de una biopsia ileal de un voluntario humano sano16. En particular, se aisló de una subpoblación de bacterias estrechamente asociadas a las células epiteliales y se demostró que tiene actividad antimicrobiana contra un panel de enteropatógenos y que forma una biopelícula en laboratorio estándar, así como en condiciones intestinales simuladas16. Nuestro estudio in vivo anterior mostró que SF1183 tiene efectos protectores sobre el epitelio intestinal, reforzando las uniones estrechas y previniendo los síntomas de colitis inducidos por dextrano-sulfato de sodio (DSS) sin efectos importantes en la composición microbiana general del intestino17.

Aquí proporcionamos más evidencias de que L. gasseri SF1183 puede influir en la homeostasis de HCT116 al afectar la proliferación celular de manera reversible, reducir la apoptosis inducida por TNF-α y aumentar el reclutamiento de ocludina en la periferia celular. Caracterizamos el efecto a nivel molecular y celular mostrando alteraciones de los marcadores de proliferación celular y cambios en la forma celular indicando fuertemente un refuerzo de las funciones de barrera.

Para estudiar los efectos de las moléculas secretadas por L. gasseri SF1183 sobre la apoptosis inducida por citocinas, se seleccionó la línea de células epiteliales intestinales HCT116 por su sensibilidad al TNF-α18. Para establecer las condiciones experimentales, se usaron diferentes concentraciones de TNF-α y diferentes tiempos de incubación para tratar las células HCT116 (Fig. 1). La inducción del programa apoptótico fue monitoreada a través del análisis de la escisión proteolítica de PARP-1 (Poly ADP-ribose polymerase 1); en particular, la detección, por western blot, de la subunidad catalítica PARP-1 (89 kDa) resultante de la actividad de Caspasa 3 se utilizó como marcador apoptótico en nuestro entorno experimental. Como era de esperar, las células HCT116 respondieron a TNFα en una forma dependiente de la dosis y el tiempo (Fig. 1). Las condiciones de TNF-α 1 nM durante 8 h de incubación se eligieron para experimentos posteriores ya que determinaba una escisión parcial de PARP-1, por lo que permitía la detección de niveles aumentados o disminuidos de apoptosis.

Las células HCT116 responden a la apoptosis inducida por TNF-α (A) Las células HCT116 se incubaron con TNF-α a las concentraciones indicadas durante 8 h. Las células se recogieron y los extractos de proteínas completas se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra PARP-1 escindido y β-actina. (B) Las células HCT116 se incubaron con TNF-α 1 nM durante 1, 4 u 8 h. Se recogieron las células y se analizaron los extractos de proteínas completas mediante transferencia Western con anticuerpos contra PARP-1 escindida y β-actina.

Para obtener el medio acondicionado (CM) para el análisis posterior, se cultivó L. gasseri SF1183 hasta la fase estacionaria, el medio se esterilizó por filtración y luego se agregó (20 % v/v) a las células HCT116 durante 16 h. Después de eso, las células se incubaron (Fig. 2, carriles 2 y 4) o no (Fig. 2, carriles 1 y 3) con TNF-α 1 nM durante 8 h sin eliminar el CM. Al final del tiempo de incubación, se recogieron las células, se prepararon extractos de proteínas de células completas y se analizaron mediante transferencia de Western con anticuerpos específicos para PARP-1 (señalización celular) de 89 kDa escindida. Como se muestra en la Fig. 2, la escisión proteolítica de PARP-1 (que es detectable en células no tratadas, ver carril 1) aumentó con el tratamiento con TNF-α (carriles 1 frente a 3) y se redujo fuertemente en presencia de CM tanto en células tratados o no con TNF-α (carriles 1 vs. 2 y 3 vs. 4; p = 0,0002, p < 0,0001). Llama la atención la reducción de la apoptosis en células no tratadas con TNF-α y sugiere un efecto antiapoptótico de moléculas presentes en la CM de L. gasseri también en condiciones fisiológicas de crecimiento en las que la apoptosis se produce a nivel basal (fig. 2, carriles 1 contra 2). No se observó reducción de la apoptosis cuando las células HCT116 fueron tratadas con medio bacteriano fresco acidificado a pH 4.0 con ácido láctico, descartando la posibilidad de que el efecto observado con el CM se deba a la acidificación del medio provocada por el crecimiento fermentativo de L. gasseri (datos no mostrados).

El Medio acondicionado de L. gasseri SF1183 reduce la apoptosis de las células HCT116. (A) las células HCT116 se incubaron o no con CM durante 16 h cuando se indicó; después de eso, las células se incubaron con TNF-α 1 nM durante 8 h adicionales cuando se indicó. Las células se recogieron y los extractos se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra PARP-1 escindida y β-actina. (B) Cuantificación de niveles de PARP-1 escindidos normalizados a partir de tres réplicas independientes realizadas por ImageLab. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t no pareada. Se indican los niveles de significación (***p = 0,0002, **** p < 0,0001).

El efecto antiapoptótico ejercido por el CM se debió a la (s) molécula (s) proteica (s) de menos de 3 kDa cuya caracterización está actualmente en progreso (Fig. 1 complementaria).

Para caracterizar los efectos ejercidos por el CM de L. gasseri SF1183 sobre las células HCT116, realizamos un ensayo MTT para analizar la viabilidad de las células HCT116 cultivadas durante 24 h en presencia de CM. Como se muestra en la Fig. 3A, el CM provocó una reducción del 30 % de la viabilidad celular (p < 0,0001). Se observó una reducción similar con la evaluación del número de células HCT116 medido en las mismas condiciones utilizadas para el experimento MTT (Fig. 3B; p < 0,0001), lo que sugiere que la reducción de la viabilidad se debió a una reducción en el número de células. y no de su actividad metabólica, lo que nos permite plantear la hipótesis de que la CM de L. gasseri contiene moléculas capaces de inhibir la proliferación de células HCT116. Para verificar tal hipótesis, se realizaron análisis de transferencia Western de biomarcadores de proliferación celular. Observamos una inducción drástica de los marcadores de detención del ciclo celular p53 y p21WAF (aumentaron alrededor de 2,5 y 8 veces, respectivamente; 0,00482; p = 0,0088) y una reducción de un marcador de proliferación celular (ciclina D1) en células incubadas con CM durante 24 h ( Fig. 3), apoyando plenamente nuestra hipótesis.

El Medio acondicionado de L. gasseri SF1183 reduce la proliferación de células HCT116. (A) Las células HCT116 en proliferación se incubaron en medio de cultivo celular completo complementado o no con CM (20 % v/v) durante 16 h; después de eso, las células se lavaron de CM y se trataron para el ensayo MTT. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t no pareada. Se indican los niveles de significación entre puntos de expresión (**** p < 0,0001). (B) Las células HCT116 en proliferación se incubaron en medio de cultivo celular completo suplementado o no con CM (20 % v/v) durante 16 h; después de eso, las células se eliminaron por lavado de CM. Después de 24 h, las células se recogieron y contaron. Se indican los niveles de significación entre puntos de expresión (**** p < 0,0001). (C) Las células HCT116 en proliferación se incubaron durante 16 h en medios de cultivo celular completos complementados con CM donde se indica; después de eso, se recogieron las células, se prepararon extractos de células enteras y se analizaron por western blot con anticuerpos contra p53, p21, ciclina D1, b-actina y Gapdh. (D) Cuantificación de los niveles de proteína normalizados a partir de tres réplicas independientes realizadas por ImageLab Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t no pareada. Se indican los niveles de significación entre puntos de expresión (* p = 0,00482; ** p = 0,0088).

El efecto negativo del CM sobre la proliferación de células HCT116 fue parcialmente reversible. Como se muestra en la Fig. 4A, las células HCT116 cultivadas en presencia de CM durante 16 h experimentaron una detención de la proliferación celular (cuadrados cerrados en la Fig. 4A) que se revirtió parcialmente cuando se eliminó el CM, las células se lavaron y se resuspendieron en medio fresco (cuadrados cerrados en la Fig. 4A). triángulos en la Fig. 4A) (p < 0,0001). La recuperación parcial del crecimiento celular tras la eliminación de CM se confirmó mediante la reducción de los niveles intracelulares de p53 y p21WAF (Fig. 4B) inducida por el tratamiento con CM. En conjunto, los resultados de la Fig. 4 indican que el CM de L. gasseri SF1183 tiene un efecto reversible sobre la proliferación de células HCT116.

El Medio acondicionado de L. gasseri SF1183 afecta la proliferación de HCT116 de manera reversible. (A) Curva de crecimiento de células HCT116 cultivadas en medio completo (control, círculos) o en medio suplementado con CM (cuadrados). Las células también se cultivaron durante 16 h en presencia de CM; después de eso, las células se lavaron de CM y se dejaron crecer hasta 24 h y 48 h en total (curva con triángulos). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de 2 vías y la prueba de comparación múltiple de Turquía. Niveles de significación (**** p < 0,0001). (B) A las 24 h de crecimiento se recogió una alícuota de células y los extractos de proteínas completas se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra p53, p21 y Gapdh. Las intensidades de las bandas se normalizaron en Gapdh de cada transferencia y se expresaron como proporción con respecto al control.

Los elementos del citoesqueleto influyen en la formación de adherencias célula-célula y célula-sustrato, por lo que juegan un papel crucial en la formación de una barrera gastrointestinal saludable cuyas funciones están relacionadas no solo con la absorción de nutrientes sino también con la protección contra patógenos e inflamación. Para funcionar correctamente, el epitelio intestinal requiere estar constituido por una capa intacta de células y uniones que sellan el espacio entre las células adyacentes. Se ha informado previamente que L. gasseri SF1183 in vivo actúa sobre las uniones estrechas17. Por lo tanto, decidimos caracterizar la función de barrera potencial ejercida por CM analizando el reclutamiento de ocludina a los contactos célula-célula. La ocludina es una proteína de membrana integral enriquecida en uniones estrechas involucradas en el mantenimiento de la integridad estructural y las funciones de barrera. Realizamos experimentos de inmunofluorescencia (IF) sobre la incubación de CM (Fig. 5). Se permitió que las células se adhirieran a los cubreobjetos durante la noche, se trataron con CM durante 16 h como de costumbre, se fijaron y se sometieron a IF con anti-ocludina, seguido de DAPI para contrarrestar la tinción de los núcleos. Curiosamente, observamos un claro reclutamiento de ocludina a los contactos célula-célula de las células tratadas (Fig. 5 A, comparación de los paneles superior e inferior). Curiosamente, una modificación drástica de la morfología celular se hace evidente con el tratamiento, lo que sugiere además un refuerzo de las uniones estrechas célula-célula. Sorprendentemente, como se muestra en la Fig. 5B, el nivel total de proteína de ocludina no aumentó con el tratamiento con CM, lo que respalda la hipótesis de que las moléculas secretadas durante el crecimiento de L. gasseri inducen el refuerzo de las funciones de barrera causadas por la relocalización de la ocludina en la periferia celular. Esta observación condujo a la hipótesis de que la protección contra la apoptosis podría deberse al refuerzo de las funciones de barrera causadas por moléculas secretadas durante el crecimiento de L. gasseri.

El medio acondicionado de L. gasseri SF1183 afecta a HCT116 y ejerce un efecto protector más amplio sobre las células HCT116. (A) Las células HCT116 se sembraron en cubreobjetos y se trataron con CM durante 16 h donde se indica. Las células se fijaron y analizaron por IF con anti-ocludina, seguido de DAPI para contrarrestar la tinción de los núcleos. Se tomaron imágenes representativas con microscopio confocal Zeiss. Barra de escala de 5 μm. (B) Las células HCT116 se incubaron con CM al 20 % v/v durante 16 h. Las células se recogieron y los extractos se analizaron mediante transferencia Western con anticuerpos contra ocludina y Gapdh.

El equilibrio entre la muerte celular y la proliferación es uno de los mecanismos homeostáticos más importantes que intervienen en la salud de los tejidos, especialmente aquellos que se caracterizan por una alta tasa de renovación celular, como el epitelio intestinal. En este sentido, las bacterias probióticas, como los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, juegan papeles importantes, incluyendo la modulación de la inflamación, la reducción del estrés oxidativo y el control de la proliferación celular19,20,21,22,23. Particularmente intrigante es la participación de las bacterias comensales en las enfermedades inflamatorias intestinales, conocidas como EII (Enfermedad Inflamatoria Intestinal), incluidas la CU (Colitis Ulcerosa) y la EC (Enfermedades Crónicas). En algunos casos, se ha demostrado que los probióticos provocan la remisión de enfermedades inflamatorias también al influir en los niveles de citoquinas inflamatorias, ejerciendo así un efecto protector sobre la barrera intestinal2,3,4,5,6,23 De hecho, una característica común de las enfermedades intestinales inflamaciones, es el aumento de las citocinas inflamatorias que, a su vez, provoca la apoptosis de las células epiteliales con alteración de la barrera intestinal. Por otro lado, la pérdida de la integridad epitelial provoca la infiltración de alimentos no digeridos, sustancias tóxicas, moléculas bacterianas y microbios en la capa submucosa, aumentando aún más la inflamación local y también los efectos sistémicos. Entre las citoquinas más producidas en estas condiciones se encuentra el factor alfa de necrosis tumoral proinflamatorio, TNF-α, conocido por desempeñar un papel importante en el control del equilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis. Dependiendo de las condiciones celulares, el TNF-α puede mediar en la supervivencia celular o en la muerte celular24. La intervención farmacológica con tratamientos anti-TNFα (corticoides y/o anticuerpos monoclonales) constituyen un potencial abordaje terapéutico en las EII24, aunque se puede observar cierto nivel de toxicidad. En algunos casos, los probióticos se han utilizado solos25 o en combinación con anticuerpos contra el TNF-α para tratar la inflamación intestinal26. Nuestra observación de que una cepa de L. gasseri SF1183 es ​​capaz de proteger las células epiteliales intestinales de la apoptosis inducida por TNF-α está en línea con estos enfoques. Debe tenerse en cuenta que esta cepa se deriva del intestino de un individuo sano, lo que subraya su beneficio para el intestino; por otro lado, L. gasseri es una especie probiótica común con efectos conocidos en la salud humana27. Además, se demostró que la cepa SF1183 puede ejercer un efecto protector en un modelo murino de colitis inducida por DSS (sulfato de dextrano y sodio) que refuerza la integridad de la barrera intestinal sin alterar la composición de la microflora intestinal17. Agregamos más evidencias sobre los efectos beneficiosos de la cepa SF1183 que brindan información a nivel celular y molecular. Las moléculas secretadas por L. gasseri inhiben la proliferación celular de forma reversible al actuar sobre la vía p53/p21WAF. Aunque los mecanismos moleculares precisos no se conocen, el aumento intracelular de p21WAF, un regulador muy conocido de la detención del ciclo celular28, podría representar el efector final del efecto CM sobre las células HCT116. Por otro lado, p21WAF también se considera un marcador antiapoptótico que parece desempeñar un papel fundamental como modulador de la apoptosis por diversos mecanismos celulares29. Los resultados preliminares sobre las moléculas potencialmente bioactivas responsables de la MC indican la presencia de moléculas de naturaleza proteica, menores de 3 kDa. Tales metabolitos, una vez identificados y aislados, pueden tener efectos benéficos directos para la salud y encontrar aplicación como posbióticos30.

Curiosamente, las células HCT116 tratadas con CM muestran un cambio drástico en la forma de la célula con una clara reubicación de la ocludina en la periferia de la célula, lo que indica un refuerzo de las uniones estrechas célula-célula. Las evidencias anteriores in vivo están en línea con esta observación considerando que la administración oral de L.gasseri SF1183 a ratones tratados con DSS muestra una clara tinción de ocludina en la superficie epitelial similar al control no tratado, indicativo de un epitelio reconstituido17. Aunque nuestros análisis se han realizado en condiciones completamente diferentes (en células humanas cultivadas incubadas con medio condicionado de L. gasseri, es decir, con moléculas potencialmente bioactivas secretadas), nuestros resultados actuales son consistentes con los obtenidos previamente in vivo. Curiosamente, en nuestras condiciones, la incubación con CM no provoca ningún aumento en los niveles de ocludina sino, en cambio, una relocalización a los contactos célula-célula.

La naturaleza molecular de las moléculas secretadas, así como los detalles sobre las vías moleculares involucradas en los efectos observados, serán tareas desafiantes en el futuro. Todas estas observaciones, junto con la reversibilidad de los efectos ejercidos sobre las células humanas, indican claramente que L. gasseri SF1183 es ​​una herramienta terapéutica segura y prometedora para mejorar las afecciones inflamatorias intestinales.

La cepa SF1183 Lactobacillus gasseri se cultivó en caldo MRS (Difco, Detroit, Mi, EE. UU.) durante 24 h a 37 °C y el cultivo diluido se inoculó en medio mínimo definido (MDM; Glucosa 10 g/L, Acetato de sodio 5 g/ L, KH2PO4 3 g/L, K2HPO4 3 g/L, MgSO4 *7H2O 0,2 g/L, l-Alanina 100 mg/L, l-Arginina 100 mg/L, l-Ácido aspártico 200 mg/L, l-Cisteína200 mg/L, L-Glutámico 200 mg/L, L-Histidina 100 mg/L, L-Isoleucina 100 mg/L, L-Leucina 100 mg/L, L-Lisina 100 mg/L, L-Metionina 100 mg/ L, l-fenilalanina 100 mg/l, l-serina 100 mg/l, l-triptófano 100 mg/l, l-tirosina 100 mg/l, l-valina 100 mg/l, ácido nicotínico 1 mg/l, ácido pantoténico 1 mg /L, Piridoxal 2 mg/L, Riboflavina 1 mg/L, Cianocobalamina 1 mg/L, Adenina 10 mg/L, Guanina 10 mg/L, Uracilo 10 mg/L). A continuación, las células de SF1183 se cultivaron en condiciones anaeróbicas durante 48 ha 37 °C. El cultivo se centrifugó (5000 g durante 10 min a temperatura ambiente (TA)) y el sobrenadante (medio acondicionado, CM) se filtró-esterilizó a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,22 μm (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

El colon humano HCT116 (ATCC CCL-247) fue un regalo de la Prof. Marina De Rosa, se cultivó de forma rutinaria a 37 °C con una confluencia del 50 % en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % en RPMI-1640 (Euroclone) suplementado con 10 %(v /v) FBS (Euroclone), penicilina-estreptomicina al 1% (Euroclone), l-glutamina al 1% (Euroclone). El CM bacteriano se analizó al 10 % y al 20 % v/v de concentración en medio de crecimiento RPMI completo durante 16 h. La última concentración dio resultados más claros en la reducción de la escisión de PARP-1 y se seleccionó para todos los experimentos posteriores; Se usó MDM (medio de crecimiento bacteriano) a una concentración del 20% v/v en medio de crecimiento completo para las muestras de control. Cuando se indicó, se añadió TNF-α (1 nM) (Millipore, Milán, Italia) a las células sin eliminar el CM y las células se recolectaron después de 8 h de tratamiento.

La viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo MTT (Sigma-Aldrich). Se basa en la reducción del anillo de tetrazolio del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) por deshidrogenasas mitocondriales, produciendo un tinte púrpura (formazán), que se puede medir espectrofotométricamente; la cantidad de formazán producido es proporcional al número de células viables31. Las células HCT116 se sembraron en placas de 96 pocillos (9 × 103 células/pocillo). Luego, las células se trataron con CM al 20 % v/v como se describe y se incubaron durante 3 h a 37 °C con una solución de MTT 1x diluida en DMEM sin Phenol Red; se eliminó el sobrenadante y se añadió isopropanol ácido 0,01 N a cada pocillo para disolver los cristales de formazán insolubles formados. La absorbancia de las muestras se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas (espectro Multiskan, Thermo)32.

Para el análisis de proliferación celular, se sembraron células HCT116 en placas de seis pocillos a una densidad de 2,5 × 105 células/pocillo y se incubaron durante 24 h en presencia de 20 % v/v. Después de 24 h de incubación, se recogieron las células y se contó el número de células en cada punto experimental con el contador Scepter-Millipore (Contador de células automatizado de mano).

Para el análisis de Western blot, las células se recogieron en tampón de lisis y se procesaron como se describe33. Luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Millipore) usando un aparato Mini trans-blot (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, la membrana se incubó con los anticuerpos indicados. Los anticuerpos primarios fueron PARP-1 escindido anti-conejo (Señalización celular EuroClone, Milán, Italia 95415-S), p21WAF1 anti-conejo (Thermo Fisher, Invitrogen, Thermo Fisher Italia 14-671581), ciclina D1 anti-conejo (SP4, Invitrogen , Thermo Fisher Italia, MA5-16356) β-actina anti-ratón (C4 Santa-Cruz Biotechnology DBA Milán, Italia SC-47778), anti-ratón Gapdh (6C5 Santa-Cruz Biotechnology DBA Milán, Italia, SC-32233), p53 anti-ratón (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan MABE327). Los anticuerpos secundarios fueron HRP anti-conejo (Sigma Aldrich Merck Millipore Milán Italia 12-348) y anti-ratón (Sigma Aldrich Merck Millipore Milán Italia A9044). Las proteínas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL, Bio-Rad) y se revelaron mediante el software Cantidad Uno del sistema ChemiDoc TM XRS (Bio-Rad). Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante el software ImageLab BioRad, se normalizaron con respecto a los controles de carga y se informaron como veces de aumento/reducción con respecto a la muestra de control. Se muestran experimentos representativos para cada transferencia.

Las transferencias originales se recortaron para eliminar muestras innecesarias y se muestran como datos sin procesar en la información complementaria.

Para los experimentos de IF, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a 105 células/pocillo, se trataron con CM al 20 % v/v durante 16 h y se trataron como se describe en 34,35,36. Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 3,7 % y se incubaron con anticuerpos anti-ocludina (Invitrogen Thermo Fisher OC-3F10) 1:250 en PBS 1x Tween al 0,05 % seguido de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Cy3 (Invitrogen Thermo Fisher Tinte Alexa Fluor 488) 1:500 en PBS 1× Tween 0,05%. Las imágenes se tomaron con un microscopio de escaneo láser confocal Axio Observer de Zeiss (Oberkochen, Alemania). Se utilizó un objetivo de 40× y el análisis de imágenes se realizó con ImageJ34.

Todos los datos se expresan como media de al menos tres réplicas biológicas ± errores estándar (SE). El análisis de varianza se llevó a cabo utilizando ANOVA unidireccional o mediante la prueba t no pareada de dos colas. El análisis estadístico se realizó con el uso de Graph-Pad Prism (Graph-Pad Software).

Los datos presentados en este estudio están disponibles en el texto principal, las figuras y el material complementario.

Fan, Y. & Pedersen, K. Microbiota intestinal en la salud y la enfermedad metabólica humana. Nature Rev. Microbiol. 19, 55–71 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Rao, RK & Samak, G. Protección y restitución de la barrera intestinal por probióticos: Implicaciones nutricionales y clínicas. actual Nutrición ciencia de la comida 9(2), 99–107 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karczewski, J. et al. Regulación de proteínas de unión estrecha epiteliales humanas por Lactobacillus plantarum in vivo y efectos protectores sobre la barrera epitelial. Soy. J. Physiol. Gastrointestinal. Fisiol hepático. 298(6), G851–G859 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Laval, L. et al. Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 y la bacteria comensal Faecalibacterium prausnitzii A2–165 exhiben efectos protectores similares a la hiperpermeabilidad de la barrera inducida en ratones. Microbios intestinales 6(1), 1–9 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ewaachuk, JB et al. Los factores bioactivos secretados por Bifidobacterium infantis mejoran la función de barrera de las células epiteliales. Soy. J. Physiol. Gastrointestinal. Fisiol hepático. 295, G1025–G1034 (2008).

Artículo Google Académico

Yan, F. et al. Las proteínas solubles producidas por las bacterias probióticas regulan la supervivencia y el crecimiento de las células epiteliales intestinales. Gastroenterología 132(2), 562–575 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rezac, S., Kok, CR, Heermann, M. & Hutkins, R. Alimentos fermentados como fuente dietética de organismos vivos. Frente. Microbiol 9, 1785 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Saggese, A., Baccigalupi, L. & Ricca, E. Formadores de esporas como microbios beneficiosos para humanos y animales. aplicación Microbiol. 1, 498–509 (2021).

Artículo Google Académico

Sanders, ME, Merenstein, DJ, Reid, G., Gibson, GR y Rastall, RA Probióticos y prebióticos en la salud y las enfermedades intestinales: de la biología a la clínica. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 16, 605–616 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Martín, R. et al. Caracterización funcional de nuevas cepas de Faecalibacterium prausnitzii aisladas de voluntarios sanos: un paso adelante en el uso de F. prausnitzii como probiótico de próxima generación. Frente. Microbiol. 8, 1226 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Depommier, C. et al. Suplementación con Akkermansia muciniphila en voluntarios humanos obesos y con sobrepeso: un estudio exploratorio de prueba de concepto. Nat. Medicina. 25, 1096–1103 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Molska, M. & Regula, J. Mecanismos potenciales de acción de los probióticos en la prevención y tratamiento del cáncer colorrectal. Nutrientes 11(10), 2453 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fujita, MMW et al. La molécula de detección de quórum de Bacillus subtilis CSF contribuye a la homeostasis intestinal a través de OCTN2, un transportador de membrana de la célula huésped. Cell Host Microbes 1, 299–308 (2007).

Artículo Google Académico

Di-Luccia, B. et al. Bacillus megaterium SF185 induce vías de estrés y afecta la distribución del ciclo celular de las células epiteliales intestinales humanas. Benif. Microbios 7, 609–620 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Iyer, C. et al. El probiótico Lactobacillus reuteri promueve la apoptosis inducida por TNF en células derivadas de leucemia mieloide humana mediante la modulación de la señalización de NF-kB y MAPK. Microbiol celular. 10, 1442–1452 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fakhry, S. et al. Caracterización de bacterias intestinales estrechamente unidas al epitelio ileal humano. Res. Microbiol. 160, 817–823 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Di-Luccia, B. et al. Lactobacillus gasseri SF1183 protege el epitelio intestinal y previene los síntomas de la colitis in vivo. Función J. Alimentos 42, 195–202 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Zwacka, RM, Stark, L. & Dunlop, MG La cinética de NF-kappaB predetermina la sensibilidad al TNF-alfa de las células de cáncer colorrectal. J. Gen Med. 2(5), 334–343 (2000).

3.0.CO;2-Q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1521-2254%28200009%2F10%292%3A5%3C334%3A%3AAID-JGM129%3E3.0.CO%3B2-Q" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/1521-2254(200009/10)2:53.0.CO;2-Q">Artículo CAS PubMed Google Académico

Mahoni, O. et al. Lactobacillus y bifidobacterium en el síndrome del intestino irritable: respuestas de los síntomas y relación con los perfiles de citoquinas. Gastroenterología 128, 541–551 (2005).

Artículo Google Académico

Cristofori, F. et al. Efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores de los probióticos en la inflamación intestinal: una puerta al cuerpo. Frente. inmunol. 12, 578386 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. Propiedades antioxidantes de las bacterias probióticas. Nutrientes 9(5), 521 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Dehghani, N., Tafvizi, F. & Jafari, P. Detención del ciclo celular y potencial anticancerígeno del probiótico Lactobacillus rhamnosus contra las células cancerosas HT-29. Bioimpactos 11(4), 245–252 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Emamie, AD et al. Los efectos de los probióticos, prebióticos y simbióticos en la reducción de las complicaciones de la EII, una revisión periódica durante 2009-2020. Aplicación J. Microbio. 130, 1823–1838 (2020).

Artículo Google Académico

Ruder, B., Atreya, R. & Becker, C. Factor de necrosis tumoral alfa en la homeostasis intestinal y enfermedades relacionadas con el intestino. En t. J. Mol. ciencia 20, 1887 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Resta-Lenert, S. & Barrett, KE Los probióticos y comensales revierten la disfunción inducida por TNF-alfa e IFN-gamma en células epiteliales intestinales humanas. Gastroenterología 130(3), 731–746 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, Z. et al. Los probióticos y los anticuerpos contra el TNF inhiben la actividad inflamatoria y mejoran la enfermedad del hígado graso no alcohólico. Hepatología 37(2), 343–350 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Selle, K. & Klaenhammer, TR Evidencia genómica y fenotípica de las influencias probióticas de Lactobacillus gasseri en la salud humana. FEMS Microbiol Rev. 37(6), 915–935 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

El-Deiry, WS et al. WAF1/CIP1 se induce en la detención y apoptosis de G1 mediada por p53. Cáncer Res. 54(5), 1169–1174 (1994).

CAS PubMed Google Académico

Janicke, RU, Sohn, D., Essmann, F. y Schulze-Osthoff, K. Las múltiples batallas libradas por el p21 antiapoptótico. Ciclo celular 6(4), 407–413 (2007).

Artículo PubMed Google Académico

Wegh, CAM, Geerlings, SY, Knol, J., Roeselers, G. y Belzer, C. Postbióticos y sus aplicaciones potenciales en la nutrición temprana y más allá. En t. J. Mol. ciencia 20(19), 4673 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saggese, A., De Luca, Y., Baccigalupi, L. & Ricca, E. Un péptido antimicrobiano específicamente activo contra Listeria monocytogenes es secretado por Bacillus pumilus SF214. BMC Microbiol. 22, 3 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mazzoli, A. et al. Las esporas de Bacillus megaterium SF185 ejercen efectos protectores contra el estrés oxidativo in vivo e in vitro. ciencia Rep. 9, 12082 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Delicato, A. et al. La oncoproteína YB-1 controla la vía PI3K/Akt al reducir el nivel de proteína pten. Genes 12, 1551 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vivo, M. 'et al' Degradación de p14ARF mediada por MDM2: un nuevo mecanismo para controlar los niveles de ARF en células cancerosas. PLoS ONE 10(2), e0117252 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Vivo, M. et al. p14ARF interactúa con la quinasa de adhesión focal y protege a las células de la anoikis. Oncogén 36(34), 4913–4928 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Montaño, E. et al. La plata coloidal induce la reorganización del citoesqueleto y el reclutamiento de E-cadherina en los contactos célula-célula en las células HaCaT. Productos farmacéuticos 12(2), 72 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Esta investigación recibió fondos de la Universidad de Nápoles de Federico II (Fondos MUR Ministero Università Ricerca-FRA Finanziamento della Ricerca di Ateneo 2021) y Department Research Funds 2021 para AP y ER.

Departamento de Biología, Universidad Federico II, Nápoles, Italia

Blanda Di Luccia, Vittoria Acampora, Anella Saggese, Viola Calabrò, Maria Vivo, Tiziana Angrisano, Ezio Ricca & Alessandra Pollice

Departamento de Medicina Molecular y Biotecnología Médica, Universidad Federico II, Nápoles, Italia

Loredana Baccigalupi

Departamento de Química y Biología A. Zambelli, Universidad de Salerno, Salerno, Italia

María Vivo

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Blanda Di Lucía

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BdL, VA y AS realizaron la mayoría de los experimentos; BdL y AS contribuyeron a la producción de CM; MV contribuyó al experimento IF ya la lectura crítica del manuscrito; VC y TA contribuyeron al diseño de experimentos, discusión y lectura crítica del manuscrito; LB contribuyó a los debates, sugerencias y redacción de manuscritos; AP y ER diseñaron los experimentos, supervisaron el proyecto y escribieron el artículo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ezio Ricca o Alessandra Pollice.

Uno de los autores (E. Ricca) actúa como consultor de Synergia Life Sciences (India) en la comercialización de cepas probióticas. Synergia Life Sciences (India) ha adquirido los derechos comerciales sobre la cepa utilizada en este estudio (Lactobacillus gasseri SF1183), pero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis o interpretación de datos o en la redacción del manuscrito. .Todos los demás autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Di Luccia, B., Acampora, V., Saggese, A. et al. Modulación de la proliferación y apoptosis de células epiteliales intestinales por Lactobacillus gasseri SF1183. Informe científico 12, 20248 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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Recibido: 24 agosto 2022

Aceptado: 16 noviembre 2022

Publicado: 24 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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