Deterioro del flujo de salida de Aβ e inflamación relacionados con la acumulación cerebrovascular de amiloide

Apr 07, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 2 (2023) Citar este artículo

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El deterioro de las vías vasculares de eliminación cerebral de β-amiloide (Aβ) contribuye a la enfermedad de Alzheimer (EA). El daño vascular se asocia comúnmente con la diabetes. Aquí mostramos en tejidos humanos y ratas modelo AD que el polipéptido amiloide de islotes transmitidos por la sangre (amilina) secretado por el páncreas perturba la eliminación cerebral de Aβ. Las concentraciones de amilina en sangre son más altas en la EA que en las personas cognitivamente no afectadas. La amilina formadora de amiloide se acumula en los monocitos circulantes y se deposita conjuntamente con Aβ dentro de la microvasculatura cerebral, lo que posiblemente implica inflamación. En ratas, la expresión pancreática de amilina humana formadora de amiloide induce de hecho inflamación cerebrovascular y co-depósitos de amilina-Aβ. El transporte de Aβ mediado por LRP1 a través de la barrera hematoencefálica y la eliminación de Aβ a través del drenaje de líquido intersticial a lo largo de las paredes vasculares están alterados, como lo indica el depósito de Aβ en los espacios perivasculares. A nivel molecular, los depósitos de amilina cerebrovascular alteran la expresión de genes cerebrales inmunes y relacionados con la hipoxia. Estos datos convergentes de humanos y animales de laboratorio sugieren que la alteración de la amilina transmitida por la sangre podría reducir potencialmente los depósitos de amilina cerebrovascular y la patología Aβ.

La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la sobreexpresión y/o el aclaramiento alterado de Aβ que puede estar relacionado con una predisposición genética de aparición temprana a la patología Aβ (EA familiar) u ocurrir esporádicamente con la edad (EA esporádica)1. Los factores que equilibran la eliminación efectiva frente a la acumulación de Aβ no se han definido completamente. Las vías bien establecidas de eliminación de Aβ cerebral incluyen el drenaje de líquido intersticial a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales, el transporte a través de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y el metabolismo por microglía y macrófagos perivasculares2,3,4.

La amilina (también conocida como polipéptido amiloide de los islotes) es una hormona de las células β del páncreas liberada junto con la insulina5, cruza la BBB6 y participa en la regulación central de la saciedad7. En personas con diabetes mellitus tipo 2 (DM tipo 2), la amilina forma amiloide pancreático8,9,10 (>95 % de prevalencia en la autopsia)10 y se asocia con inflamación pancreática11,12,13. Los datos de diferentes equipos de investigación muestran que la amilina se coagrega sinérgicamente con Aβ dentro del tejido parenquimatoso cerebral y también se deposita dentro de las arteriolas y capilares cerebrales, en entornos de EA esporádica y familiar14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24. Las concentraciones más altas de amilina derivada del páncreas en el sistema nervioso central se asocian con una mayor frecuencia de deterioro cognitivo21,22,23,24. En ratas APPswe/PS1dE9 (APP/PS1), la expresión pancreática de amilina humana (la amilina de roedores no es amiloidogénica) acelera los déficits de comportamiento y la deposición de Aβ en el cerebro21. En ratas sin patología Aβ (la rata HIP), la expresión pancreática de amilina humana formadora de amiloide promueve depósitos de amilina cerebrovascular que conducen a neuroinflamación18,25,26 y déficits neurológicos18,21,25. Estos datos forman la base de nuestra hipótesis de que el aumento de las concentraciones de amilina formadora de amiloide en la sangre promueve el depósito de amilina cerebrovascular y son factores críticos que contribuyen a la inflamación perivascular y la eliminación interrumpida de Aβ en la EA. Para determinar una asociación potencial entre la amilina derivada del páncreas en la sangre y la eliminación de Aβ cerebral alterada, medimos las concentraciones de amilina en la sangre de humanos con demencia de tipo EA frente a individuos sin deterioro cognitivo y evaluamos las relaciones con el parénquima cerebral y Aβ vascular. Para comprender el mecanismo y descubrir nuevos objetivos terapéuticos para reducir/prevenir el desarrollo de la patología cerebral Aβ, realizamos caracterizaciones fisiopatológicas comparativas de las vías de eliminación de Aβ cerebral en ratas transgénicas que expresan amilina humana formadora de amiloide en el páncreas versus ratas de control que expresan amilina humana endógena, no -amilina de rata amiloidogénica. Los resultados de este estudio podrían ayudar a comprender mejor cómo la alteración de la amilina transmitida por la sangre puede usarse como una estrategia terapéutica para reducir potencialmente los depósitos de amilina cerebrovascular y la patología Aβ.

La hipótesis general probada en nuestro estudio junto con el flujo de trabajo y los métodos se describen gráficamente en la Fig. 1a, b. Usando ELISA, medimos las concentraciones de amilina en muestras de sangre recolectadas de individuos sin deterioro cognitivo (CU; n = 42) y personas con demencia tipo sAD (DEM; n = 19) o deterioro cognitivo leve (DCL; n = 19) (ver Tabla 1 para estadísticas resumidas por edad y sexo). Los grupos tenían concentraciones de glucosa en sangre similares (112,9 ± 5,71 mg/dL frente a 119,1 ± 9,43 mg/dL frente a 113,2 ± 5,10 mg/dL; ANOVA de una vía, P = 0,79) y edad (79,35 ± 2,18 años frente a 81,35 ± 1,78 años frente a 77,60 ± 0,66 años, ANOVA de una vía, P = 0,14). Las estadísticas descriptivas de las concentraciones de amilina en sangre se muestran en la figura complementaria S1a. Las concentraciones de amilina en sangre fueron más altas en los grupos DEM frente a CU (Fig. 1c) (análisis de varianza unidireccional de Kruskal-Wallis, P <0.001). En los grupos divididos según el estado de la DM tipo 2, las concentraciones de amilina en sangre fueron muy variables (Figura complementaria S1b), lo que puede reflejar los efectos de los medicamentos antidiabéticos. Se evaluó aún más un vínculo potencial entre el aumento de las concentraciones de amilina en sangre y la diabetes midiendo la relación amilina-insulina en las mismas muestras de sangre que en la Fig. 1c. Los ELISA de insulina y amilina muestran que el aumento de las concentraciones de insulina en sangre está asociado con mayores concentraciones de amilina en sangre (r = 0,52; P <0,0001) (Fig. 1d y Fig. S1c complementaria). El coeficiente de correlación por pares demuestra que la hiperamilinemia y la hiperinsulinemia están correlacionadas en la EA.

Función putativa de amilina (panel verde) y patología (paneles rojos) (a) junto con flujo de trabajo y métodos (b). c Concentraciones de amilina en sangre en personas con demencia (DEM; n = 19), deterioro cognitivo leve (MCI; n = 19) y personas sin deterioro cognitivo (CU; n = 42). d Coeficiente de correlación por pares (r) entre las concentraciones de amilina e insulina en las mismas muestras de sangre que en (c). e Clasificación por citometría de flujo de monocitos CD14+ circulantes con amilina positiva (Q2) o negativa (Q1) en sangre con concentraciones de amilina del cuartil inferior frente a las del cuartil superior. f Imágenes microscópicas confocales que muestran amilina sumergida en monocitos CD14+ (n = 3). Coeficiente de correlación por pares (r) entre la amilina y las concentraciones de Aβ42 en cerebros humanos, incluidas las personas con sAD (n = 42) y sin AD (n = 18) (g), y entre la concentración de amilina en plasma antemortem coincidente y la concentración de amilina en tejido cerebral autopsiado , incluidas personas con sAD (n = 12) y sin AD (n = 8) individuos (h) (los valores atípicos potenciales se eliminaron del análisis; se muestran en la Fig. S1e complementaria). i Análisis IHC usando anticuerpos anti-amilina (marrón) y anti-Aβ (verde) en secciones en serie de un cerebro con sAD (n = 18). j Análisis microscópico confocal y ensayo de ligadura de proximidad (PLA) de amilina-Aβ que muestra depósitos vasculares de amilina-Aβ en un cerebro con sAD. Análisis IHC de cerebros con fAD que muestran depósitos de Aβ en espacios perivasculares y paredes de vasos con acumulación de amilina dentro de la luz (k, l) y depósitos de amilina en la pared del vaso (m) o pared de vasos (n) y depósitos de Aβ en espacios perivasculares ( n = 32). Los datos se presentan como cajas y bigotes o análisis de correlación; Kruskal-Wallis unidireccional de varianza, los datos son medias ± SEM.

Debido a que el aumento de la secreción de amilina formadora de amiloide promueve la acumulación de amilina en los macrófagos y las células dendríticas dentro de los islotes pancreáticos11,12,13, planteamos la hipótesis de que los niveles de amilina en sangre crónicamente elevados desencadenan una inflamación sistémica. Usando citometría de flujo, clasificamos fracciones de monocitos CD14+ circulantes positivos para amilina. Cuantificamos fracciones de monocitos circulantes positivos para amilina (Q2) y negativos para amilina (Q1) en muestras de sangre con concentraciones de amilina en el cuartil superior (>3,5 pM) y en aquellas con concentraciones de amilina en el cuartil inferior (<1,5 pM) . Las muestras de sangre con concentraciones de amilina en el cuartil superior (>3,5 pM) contenían fracciones aumentadas de monocitos CD14+ positivos para amilina (Q2) (Fig. 1e). Las imágenes microscópicas confocales confirmaron las inclusiones de amilina en los monocitos CD14+ circulantes (Fig. 1f).

A continuación, nuestro objetivo fue delinear las posibles asociaciones entre el aumento de la concentración de amilina en sangre y la acumulación de amilina y Aβ en el cerebro. Utilizando ELISA, medimos las concentraciones de amilina y Aβ42 en homogeneizados de la corteza temporal de personas con EA identificadas por características neuropatológicas bien establecidas27,28,29,30,31 (n = 42; n = 22 con DM tipo 2) y de individuos sin patología sAD (n = 18; n = 6 con DM tipo 2) (ver Tabla 2 para datos clínicos). Los individuos tienen una edad similar (85,65 ± 7,04 años frente a 87,22 ± 7,30 años), en los grupos sAD frente a no AD. Las concentraciones de amilina cerebral fueron más altas en las personas del sAD en comparación con las del grupo de control (prueba t no pareada, P < 0,01) (Fig. S1d complementaria), en consonancia con los resultados anteriores de otras cohortes15,21. No hubo diferencia en los niveles de amilina cerebral entre aquellos con DM tipo 2 versus aquellos sin (Fig. S1e complementaria); sin embargo, el análisis no controló los efectos potenciales de los medicamentos glucémicos ni los medicamentos administrados a personas con deterioro cognitivo. El aumento de las concentraciones de amilina en el cerebro se asoció con mayores concentraciones de Aβ42 (r = 0,34; P <0,05) (Fig. 1g), de acuerdo con la relación amilina-Aβ42 identificada recientemente en los cerebros con fAD21. Usando homogeneizados de tejido cerebral y plasma emparejados que estaban disponibles en esta cohorte (n = 12 en el grupo sAD n = 8 controles), evaluamos la relación entre las concentraciones de amilina en plasma antemortem y las concentraciones de amilina en tejido cerebral autopsiado. El coeficiente de correlación por pares sugiere una posible relación entre los niveles de amilina circulante y la propensión de la amilina a acumularse en el cerebro (r = 0,40; P = 0,09) (Fig. 1h) (el análisis excluyó posibles valores atípicos de las concentraciones de amilina en el tejido cerebral; Fig. S1e). El pequeño tamaño de muestra de las muestras de plasma y cerebro emparejadas es una limitación.

Para probar la posible superposición de amilina y Aβ en la BBB, analizamos cerebros con sAD y fAD en busca de evidencia histológica de colocalización de amilina-Aβ vascular mediante inmunohistoquímica (IHC), microscopía confocal y ensayo de ligadura de proximidad (PLA) con anti-amilina y anticuerpos anti-Aβ. Para la desconvolución y el análisis de las señales de intensidad de la inmunorreactividad de la amilina en las imágenes IHC, el tejido pancreático de un paciente con DM tipo 2 sirvió como control positivo para el depósito de amilina (Fig. S1f complementaria). El análisis histopatológico de la colocalización de amilina-Aβ cerebrovascular se resume en la Tabla 3. Imágenes representativas de cortes en serie y tinción IHC con anticuerpos anti-amilina, anti-Aβ y anti-amilina y anti-Aβ combinados en tejidos de la corteza temporal de un 83- años de edad con sAD y DM tipo 2 se muestran en la Fig. 1i. El análisis microscópico confocal y PLA con los mismos anticuerpos anti-amilina y anti-Aβ confirmaron aún más el depósito de amilina-Aβ cerebrovascular (Fig. 1j). La señal PLA muestra una consistencia general con la colocalización de amilina-Aβ que aparece dentro de la pared arteriolar. A modo de comparación, las imágenes del análisis IHC del tejido de la corteza temporal de una mujer de 86 años sin deterioro cognitivo y sin diabetes tipo 2 se muestran en la figura complementaria S1g. En la Fig. 1k-n y las Figs. Suplementarias. S1h, presentamos ejemplos adicionales de colocalización de amilina-Aβ cerebrovascular a partir de análisis IHC en un subconjunto de cerebros de pacientes con fAD y con acumulación de amilina documentada a través de IHC y ELISA21. Los depósitos de Aβ están presentes en los espacios perivasculares y las paredes arteriales, mientras que la amilina parece acumularse dentro de la luz (Fig. 1k, l), la pared arterial (Fig. 1m) y en el lado luminal (Fig. 1n). El análisis IHC detectó amilina en aproximadamente 2/3 del total de vasos sanguíneos que se tiñeron positivos para Aβ en cerebros con fAD (Tabla 3). El análisis microscópico confocal de la sección del cerebro teñida triplemente con anticuerpos de actina anti-amilina, anti-Aβ y anti-α de células de músculo liso (SMC) respalda aún más los patrones de coubicación en los que Aβ está presente en áreas perivasculares y amilina dentro de la pared de los vasos sanguíneos. (Fig. S1i complementaria).

Nuestros datos muestran la acumulación de amilina formadora de amiloide pancreático en la sangre y los monocitos circulantes, y la amilina co-localizada con Aβ en la vasculatura cerebral, en personas con AD. Los resultados sugieren la hipótesis de que el aumento de las concentraciones de amilina formadora de amiloide en la sangre perturba la salida de Aβ cerebral, lo que posiblemente implica inflamación.

Utilizamos ratas en las que las células β pancreáticas expresan amilina humana (el modelo de rata HIP18) y ratas de tipo salvaje (WT) que expresan la amilina de rata endógena no amiloidogénica, para determinar los efectos potencialmente causales del aumento de las concentraciones de amilina humana formadora de amiloide en el sangre en el desarrollo de la inflamación sistémica y cerebrovascular. La especificidad de la expresión del ARN de amilina humana en el páncreas y la falta de ARN de amilina humana en el cerebro en ratas HIP se documentó mediante qRT-PCR, como se informó anteriormente25. Las ratas HIP macho y hembra desarrollan DM tipo 2 asociada con el depósito de amilina amiloide pancreática18,32, desregulación de la glucosa18,32 y déficits neurológicos18,25. La desregulación de glucosa y los déficits de comportamiento se desarrollan más tarde (alrededor de 6 meses) en ratas HIP hembra frente a macho, como informamos anteriormente18. Las concentraciones de amilina en sangre aumentan con el aumento de glucosa en sangre (Fig. 2a). A la edad en que las ratas HIP desarrollan déficits neurológicos (~16 meses) (Fig. S2 complementaria), las concentraciones de amilina en sangre en ratas macho HIP estaban dentro de un rango similar al de las personas con deterioro cognitivo (Fig. 2b).

Concentraciones transversales de amilina y glucosa en sangre en ratas HIP de 6 a 8 meses de edad (n = 6), de 10 a 12 meses de edad (n = 13) y de 15 a 16 meses de edad (n = 12). b Concentraciones de amilina en sangre en humanos con demencia (DEM) frente a ratas HIP; mismas ratas que en (n = 16) (a). c Clasificación por citometría de flujo de monocitos CD14+ circulantes positivos para amilina en sangre de las mismas ratas que en (b) (n = 10 machos/grupo). d Imágenes microscópicas confocales de monocitos circulantes teñidos para CD14+ (rojo) y amilina (verde) en sangre de las mismas ratas que en (b) (n = 5 muestras de sangre/grupo). e Interleucina (IL)-1β ELISA en plasma de ratas HIP frente a WT similar a los grupos en (b) (n = 10 machos/grupo). f Imágenes microscópicas confocales que muestran depósitos de IL-1β y amilina en los vasos sanguíneos del cerebro en ratas estudiadas en (b) (n = 3 machos/grupo). g Análisis IHC de secciones de cerebro de ratas HIP y WT de los mismos grupos que en (c) que muestran depósitos vasculares de amilina (marrón) y reacciones astrogliales (tinciones verdes para proteína ácida fibrilar glial; GFAP) (n = 5 machos/grupo) . Análisis IHC de microglía fagocítica (CD68) (h) y reclutamiento de monocitos vasculares (CD11b) (i) en secciones de cerebro de ratas HIP frente a WT de los mismos grupos que en (b) (n = 10 machos/grupo). Los datos son medias ± SEM; Prueba t no pareada para todos los paneles.

Usando citometría de flujo, encontramos un mayor número de monocitos CD14 + y monocitos CD14 + positivos para amilina en sangre de ratas HIP en comparación con los de la sangre de compañeros de camada WT (Fig. 2c). Al igual que en la sangre humana de personas con AD (Fig. 1f), las imágenes microscópicas confocales de monocitos circulantes teñidos para CD14+ (también tienen depósitos de amilina (Fig. 2d).

La amilina formadora de amiloide pancreático activa el inflamasoma NLRP3 en los macrófagos y las células dendríticas, lo que conduce a la maduración de la interleucina (IL)-1β y la inflamación de los islotes pancreáticos11,12,13. La concentración de citocina proinflamatoria IL-1β en plasma fue mayor en ratas HIP que en compañeros de camada WT (Fig. 2e). Esto se asoció con una mayor intensidad de la señal de inmunorreactividad de IL-1β en las paredes de los vasos sanguíneos del cerebro de rata HIP (Fig. 2f), de acuerdo con los datos publicados previamente del análisis de IL-1β en tejido parenquimatoso de cerebro de rata HIP25,26. Usando IHC con anticuerpos anti-amilina y anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP), detectamos una reacción astroglial inducida por amilina cerebrovascular en cerebros de rata HIP (Fig. 2g). Esto parece estar asociado con el reclutamiento vascular de monocitos y macrófagos como lo sugiere IHC con anticuerpos contra el grupo de diferenciación (CD) 68 y CD11b (Fig. 2h, i). Estos resultados indican que la exposición crónica a la amilina formadora de amiloide secretada por el páncreas es un desencadenante de la inflamación cerebrovascular sistémica y local.

La intensidad de la señal de fluorescencia de tioflavina T (ThT) en los lisados ​​sanguíneos fue mayor en ratas HIP que en compañeros de camada WT (Fig. 3a), lo que indica la acumulación de amilina formadora de amiloide en la sangre. Usando ELISA, encontramos mayores concentraciones de amilina en lisados ​​​​de microvasos cerebrales de rata HIP en comparación con lisados ​​​​de microvasos cerebrales de compañeros de camada WT, de 16 meses de edad (Fig. 3b). La tinción conjunta de cortes de cerebro de ratas HIP y WT con anticuerpos anti-Aβ y anti-amilina detectó la deposición vascular de amilina-Aβ en ratas HIP (Fig. 3c). En cerebros de ratas HIP, se detectó inmunorreactividad de amilina en el lado luminal del vaso sanguíneo, a menudo con Aβ dentro de los espacios perivasculares y dispersos a través del tejido parenquimatoso.

a Intensidades de señal de fluorescencia de tioflavina T (Th T) en lisados ​​de sangre de ratas HIP y compañeros de camada WT (15-16 meses de edad; n = 10 machos/grupo). b Concentraciones de amilina en lisados ​​de microvasos cerebrales en ratas HIP y WT similares a las de (a) (n = 10 machos/grupo). c Análisis IHC de cerebros de ratas HIP que muestran depósitos de Aβ (verde) en espacios perivasculares y acumulación de amilina (marrón) dentro de la luz. (n = 5 hombres/grupo; edad 15–16 meses). d Promedio de intensidades de señal de fluorescencia de tioflavina T (Th T) en lisados ​​sanguíneos de compañeros de camada APP/PS1/HIP y APP/PS1 de 15 a 16 meses de edad (n = 10 ratas macho/grupo). e Concentraciones de amilina en lisados ​​de microvasos cerebrales de las mismas ratas que antes. f Micrografías IHC representativas de secciones de cerebro de ratas APP/PS1/HIP y APP/PS1 coteñidas con anticuerpos anti-amilina (marrón) y anti-Aβ (verde) (n = 5 machos/grupo; edad 15–16 meses ) (3 diapositivas/cerebro). Imágenes representativas de IHC y análisis de microglía fagocítica (CD68) (g) y reclutamiento de monocitos vasculares (CD11b) (h) en secciones de cerebro de machos de rata APP/PS1/HIP vs APP/PS1 (n = 10 machos/grupo; edad 16- meses). Los datos son medias ± SEM; Prueba t no pareada para todos los paneles.

Además, empleamos ratas APP/PS1 con expresión pancreática de amilina humana (ratas APP/PS1/HIP) para estudiar el impacto de la amilina humana formadora de amiloide pancreático en Aβ cerebrovascular en el contexto de una patología similar a la EA. Las ratas APP/PS1/HIP desarrollan depósitos de amilina-Aβ en el cerebro21. En comparación con los compañeros de camada APP/PS1, las ratas APP/PS1/HIP han aumentado la intensidad de la señal Th-T en los lisados ​​sanguíneos (Fig. 3d) y la acumulación de amilina en los microvasos cerebrales (Fig. 3e). IHC con anticuerpos anti-Aβ (verde) y anti-amilina (marrón) reveló áreas de tejido vascular de co-localización de amilina-Aβ en cerebros de ratas APP/PS1/HIP, mientras que los compañeros de camada APP/PS1 no tenían depósitos cerebrovasculares de amilina-Aβ (Fig. .3f). Esto se asoció con el reclutamiento vascular de monocitos y macrófagos según lo indicado por IHC con anticuerpos contra CD68 y CD11b (Fig. 3g, h), similar a la inflamación cerebrovascular demostrada en ratas HIP (Fig. 2h, i).

Nuestros resultados muestran que el inicio tardío de los déficits neurológicos en ratas con expresión pancreática específica de amilina humana (Fig. 2 complementaria) está asociado con la deposición de amilina en las arteriolas cerebrales (incluidos los co-depósitos con Aβ) (Fig. 3c, f) y en capilares (Fig. 2b, e), y con el desarrollo de inflamación sistémica y cerebrovascular (Figs. 2 y 3g, h). Estos resultados replican nuestros hallazgos en humanos (Fig. 1).

El drenaje de líquido intersticial deteriorado en el cerebro está indicado por la presencia de depósitos perivasculares de Aβ (como en la Fig. 3c, f) y se atribuye a alteraciones en la contractilidad y relajación de las SMC vasculares2,3,4. La homeostasis del óxido nítrico (NO)-arginasa endotelial, un mediador del tono miogénico vascular33, está alterada en ratas HIP y se asocia con disfunción endotelial34. Utilizamos experimentos de estrés oxidativo de flujo sanguíneo cerebral (CBF), miografía de presión y SMC vascular en ratas HIP versus WT para probar una posible asociación entre el aumento de las concentraciones de amilina formadora de amiloide en la sangre y el deterioro de la vasodilatación cerebral.

Las mediciones longitudinales de resonancia magnética del cerebro revelaron alteraciones estructurales consistentes que progresaron más rápidamente con el envejecimiento en ratas HIP frente a WT (Fig. 4a). La perfusión cerebral se evaluó mediante marcaje de espín arterial pseudocontinuo (ASL)35. Los resultados muestran un CBF reducido en ratas HIP, de 15 a 16 meses de edad (Fig. 4b). Las concentraciones plasmáticas de nitrito y nitrato (productos finales estables de NO) aumentaron en ratas HIP frente a WT, de 15 a 16 meses de edad (Fig. 4c), posiblemente como resultado de la inflamación sistémica en ratas HIP (como lo sugieren los datos en la Fig. 2). Los experimentos de miografía de presión utilizando arterias piales aisladas demuestran que tanto las arterias WT como HIP desarrollan tono arterial36 (p. ej., constricción inducida por la presión) (Fig. 4d); sin embargo, las arterias de las ratas HIP muestran un tono arterial elevado en comparación con las ratas WT con una presión intravascular creciente (p. ej., 60–100 mmHg) (Fig. 4d, e). Para verificar aún más el deterioro del tono arterial inducido por amilina, utilizamos arterias cerebrales aisladas de ratas WT y ratas knockout para amilina (AKO), y de ratas AKO inyectadas por vía intravenosa con amilina humana formadora de amiloide en un régimen que replica la intensidad de la señal de inmunorreactividad de la amilina. medido en plasma humano18 (es decir, 60 µg/kg de peso corporal; inyección IV diaria a través de la vena de la cola durante 1 semana). El tono arterial es similar en las arterias cerebrales de ratas WT y AKO (Fig. 4f); sin embargo, el tono arterial se elevó en las arterias de ratas inyectadas con amilina humana (Fig. 4f). Estos resultados sugieren un efecto directo de la amilina sobre el deterioro del tono arterial. De acuerdo con estos resultados, las SMC vasculares de ratas HIP han aumentado la peroxidación de lípidos (Fig. 4g, h), que también ocurre en SMC incubadas con amilina humana exógena (Fig. S3a, b complementaria).

una resonancia magnética ponderada en T2 y volúmenes de hiperintensidad ventricular longitudinal en ratas HIP frente a WT (n = 4–5 machos/grupo). b Mapas de CBF y CBF global en ratas HIP y WT, de 15 a 16 meses de edad (9 machos/grupo). c Concentraciones transversales de nitrito y nitrato en plasma en ratas HIP y WT (n = 6 machos/grupo/edad). Trazas de diámetro en las arterias piales de machos de rata HIP y WT a diferentes presiones intravasculares (d), y tono arterial de las arterias piales (e) medido a la presión intravascular indicada (2–3 arterias/rata, n = 6–7 machos/grupo , 15-16 meses de edad). f Igual que en (e) en las arterias cerebrales posteriores de ratas WT y amilina knockout (AKO), y en ratas AKO inyectadas por vía intravenosa con amilina humana (n = 3 machos/grupo, de 9 a 10 meses de edad). g, h Peroxidación lipídica en SMC de la arteria pial de machos de rata WT y diabéticos HIP medidos con Liperfluo (g; N = 62 SMC de 4 ratas WT y 70 células de 4 ratas HIP) y C11-BODIPY581/591 (h; N = 87 SMC de 7 ratas WT y 68 células de 4 ratas HIP). i Actividad de arginasa y concentraciones de arginasa-1 y arginasa-2 en lisados ​​de microvasos cerebrales HIP frente a WT (n = 7 hombres/grupo; edad 15–16 meses). j Mecanismo propuesto: las concentraciones crónicamente aumentadas de amilina formadora de amiloide pancreático en la sangre causan estrés oxidativo dentro de la pared vascular que conduce a la desregulación de la NO-arginasa y al deterioro de la función SMC y del tono miogénico. Los datos son medias ± SEM. Prueba no paramétrica de Mann-Whitney para paneles (g, h), prueba t no pareada para los otros paneles.

El aumento de la peroxidación lipídica contribuye al estrés oxidativo en la pared vascular y reduce la biodisponibilidad del NO, alterando la función vasodilatadora. Tanto la actividad como la expresión de la arginasa aumentaron en los lisados ​​​​microvasculares cerebrales de ratas HIP en comparación con los de los compañeros de camada WT (Fig. 4i), lo que sugiere una desregulación de la arginasa-NO (Fig. 4j; mecanismo propuesto). Un posible impacto del aumento de la concentración de amilina en la sangre sobre la regulación de la arginasa-NO cerebrovascular se probó más a fondo en lisados ​​​​microvasculares cerebrales de ratas inyectadas por vía intravenosa con amilina humana formadora de amiloide (Fig. S3c complementaria).

Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que los depósitos perivasculares de Aβ en ratas HIP y APP / PS1 / HIP (Fig. 3c, f) están potencialmente relacionados con la contracción / relajación espontánea alterada de las SMC cerebrovasculares causadas por el desarrollo de vasculopatía por amilina.

Los análisis de transferencia Western de Aβ en homogeneizados de tejido cerebral (Fig. 5a) y el análisis de transferencia Western de Aβ enriquecido por inmunoprecipitación en plasma y homogeneizados de cerebro (Fig. 5b) muestran la deposición de Aβ cerebral en ratas HIP, incluso en ausencia de sobreexpresión de Aβ inducida genéticamente (es decir, como en ratas APP/PS1). La relación entre los niveles de Aβ del plasma y el cerebro fue menor en HIP en comparación con las ratas WT, lo que sugiere un posible deterioro del transporte de Aβ del cerebro a la sangre. En estos experimentos, utilizamos homogeneizados de cerebro de una rata APP/PS1 de 12 meses de edad como controles positivos para la acumulación de Aβ en el cerebro.

a Análisis de transferencia Western de tejido cerebral Aβ en ratas WT y HIP (n = 4–5 machos/grupo; edad 15–16 meses) con Aβ40 de rata y homogeneizado de cerebro de rata APP/PS1 utilizados como controles positivos para la señal de inmunorreactividad de Aβ. b Salida estimada de Aβ del cerebro a través de inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western de Aβ en plasma y homogeneizados de cerebro de ratas WT y HIP (similares a los de a), con homogeneizado de cerebro de rata APP/PS1 utilizado como control positivo para la señal de inmunorreactividad de Aβ. c Acción propuesta de la amilina sobre el transporte de Aβ a través de la BBB. d Microscopía confocal y análisis STORM de amilina en microvasos cerebrales aislados de ratas HIP (n = 47 microvasos) y WT (n = 21 microvasos) (n = 3 machos/grupo; edad 15–16 meses). Análisis de microscopía confocal de secciones seriadas de cerebros de rata HIP teñidos con tioflavina S (Thio S) o amilina (e) y con el marcador de peroxidación lipídica 4-HNE o amilina (f) (n = 3 machos similares a los de d). Análisis de transferencia Western de P-gp (g) y LRP1 (h) en lisados ​​​​de microvasos cerebrales de ratas HIP y WT (n = 5–7 machos/grupo similares a los de a) y en CE microvasculares cerebrales incubadas con amilina humana. Los datos son medias ± SEM.

El transporte de Aβ a través de la BBB está mediado por la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1), un receptor de apolipoproteína E (APOE)37,38,39. En la BBB, LRP1 se une a Aβ en el lado cerebral del endotelio, lo que facilita la liberación de Aβ en la circulación sistémica (Fig. 5c). La glicoproteína P 1 (P-gp; también conocida como miembro 1 de la subfamilia B del casete de unión a ATP; ABCB1), una bomba de salida dependiente de ATP, media en la liberación de Aβ en el lado sanguíneo de la BBB40,41. ApoA-I estabiliza la P-gp en las células endoteliales (EC)42,43 y se une a la amilina en ratas HIP, como describimos en nuestro estudio anterior18. Aquí, medimos las asociaciones de depósito de amilina cerebrovascular con alteraciones mediadas por estrés EC en la expresión de proteína LRP1 y P-gp en la microvasculatura cerebral de rata HIP. La microscopía confocal y el análisis de los depósitos de amilina utilizando imágenes de súper resolución de Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM) mostraron la yuxtaposición de señales de intensidad óptica de amilina y caveolina-1 (Fig. 5d), lo que confirma la deposición de amilina en capilares cerebrales de rata HIP (ver Fig. 3b ). El depósito de amilina en los capilares cerebrales tiene propiedades bioquímicas de amiloide (Fig. 5e) y desencadena la acumulación del marcador de peroxidación lipídica 4-hidroxinonenal (4-HNE) (Fig. 5f) que demuestra el estrés oxidativo inducido por amiloide de amilina dentro de la BBB. Esto se asoció con niveles de proteína P-gp y LRP1 regulados a la baja, como lo indica el análisis de transferencia Western de estas proteínas en lisados ​​​​capilares cerebrales de ratas HIP y WT y en lisados ​​​​de EC incubados con amilina humana formadora de amiloide (Fig. 5g, h) .

Para determinar si la amilina formadora de amiloide puede influir directamente en la salida de Aβ mediada por LRP1, empleamos un modelo in vitro de BBB en el que la monocapa de EC se expuso a amilina humana formadora de amiloide en el lado luminal y Aβ en el abluminal (lado del cerebro). ), como se muestra en la Fig. 6a. El modelo BBB se probó para la formación de monocapas midiendo la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) (Fig. 6b). Todos los experimentos se realizaron con una monocapa EC completamente formada caracterizada por un TEER máximo = 110 ± 5 Ω/cm2. La respuesta a la dosis de EC microvasculares cerebrales a la incubación con varias concentraciones de amilina humana durante 24 h se muestra en la Fig. 6c. Los niveles de proteína LRP1 disminuyeron con concentraciones crecientes de amilina humana; La expresión de LRP1 se redujo en más del 50 % en EC incubadas con amilina humana 10 µM (Fig. 6c). La viabilidad de EC no se vio afectada por la incubación con amilina humana (Fig. 6d), lo que indica que la disminución de la expresión de la proteína LRP1 no se debe a la muerte celular. A continuación, aplicamos péptido de amilina humana (10 μM) o vehículo en el lado luminal (sangre) durante 24 h seguido de lavado de las monocapas de EC con PBS y aplicación de FITC-Dextrano o carboxifluoresceína marcada Aβ42 (Aβ42-FAM) en abluminal (cerebro). ) lado de la BBB durante 1 hora. Las cantidades de Aβ42-FAM y FITC-Dextrano que cruzaron la monocapa se estimaron a partir de la intensidad de fluorescencia en las muestras de medio recolectadas del lado luminal y se usaron para calcular el cociente de transcitosis de Aβ. El pretratamiento con amilina redujo el cociente de transcitosis de Aβ en un 20 ± 5% (P <0,05) (Fig. 6e).

a Representación de dibujos animados del modelo BBB in vitro (monocapa de CE - cámara luminal; astrocitos - cámara abluminal) utilizado en experimentos de transcitosis Aβ. b Resistencia eléctrica transendotelial (TEER) en monocapas de EC (n = 20 preparados) en función de los días de cultivo. c Cuantificación representativa de Western blot y densitometría de LRP1 en lisados ​​de EC vasculares microvasculares primarias de cerebro de rata tratadas con vehículo o varias concentraciones de amilina humana (500 nM, 1 µM, 5 µM y 10 µM) durante 24 h (n = 3 preparaciones/ prueba). d Porcentaje de viabilidad celular del ensayo MTS en EC tratadas con amilina humana formadora de amiloide (500 nM, 1 µM, 5 µM y 10 µM) o vehículo, durante 24 h. e El cociente de transcitosis (TQ) de Aβ42 a través de la BBB in vitro, en monocapas de EC tratadas con vehículo y con amilina humana. f Niveles de ARNm de LRP1 (diferencia de veces usando el método 2−ΔΔCt) medidos con qRT-PCR en lisados ​​de EC tratados con vehículo, amilina humana o amilina de rata. g Niveles de ARNm de LRP1 medidos por qRT-PCR en lisados ​​de capilares cerebrales de las mismas ratas que en la Fig. 5h. h, i niveles de expresión de miARN (miR)-103 y miR-107 medidos por qRT-PCR en lisados ​​de EC tratados con vehículo o amilina humana (igual que en la Fig. 5h), y en lisados ​​de capilares cerebrales de las mismas ratas que en la Fig. .5h. j Esquema de TargetScan que muestra las regiones de consenso para miR-205, miR200bc-3p/429 y miR-103 y miR-107. Análisis de transferencia Western de LRP1 de EC tratadas con miARN (miR) 103 y miR-107 en comparación con el control de miR (n = 3 preparaciones/grupo) (k), así como de LRP1 (l) y P-gp (m) de EC tratadas con antagomir (amiR) 103 y amiR-107 en comparación con células tratadas con control de amiR (n = 3 preparaciones/grupo). Los datos son la media ± SEM. ANOVA unidireccional con post hoc de Dunnett (F). Prueba t no pareada para los otros paneles.

En las EC incubadas con amilina humana formadora de amiloide 10 µM durante 24 h, los niveles de ARNm de LRP1 se elevaron en comparación con las EC de control (tratadas con vehículo) y las EC incubadas con la misma concentración de amilina de rata (Fig. 6f). Los niveles de ARNm de LRP1 aumentaron en lisados ​​​​capilares cerebrales HIP frente a WT (Fig. 6g). En conjunto, los resultados indican que la amilina formadora de amiloide puede influir directamente en la salida de Aβ mediante la supresión de la expresión de la proteína de transporte a nivel postranscripcional.

Los datos publicados muestran que los miARN parálogo miR-103 y miR-107 están regulados al alza por el estrés oxidativo44 y reprimen la traducción de LRP1 en varias líneas celulares45. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que miR-103 y miR-107 están involucrados en la regulación negativa de LRP1 inducida por amilina en las CE microvasculares. Las EC incubadas con amilina humana formadora de amiloide 10 µM durante 24 h mostraron niveles aumentados de miR-103 y miR-107, como lo indican los datos de RT-PCR de lisados ​​de EC (Fig. 6h). Utilizando los mismos lisados ​​​​capilares de ratas HIP y WT que en el anterior (Fig. 6g), detectamos niveles más altos de miR-103 y miR-107 en capilares de ratas HIP frente a WT (Fig. 6i), de acuerdo con los resultados in vitro (Fig. .6h). TargetScan predice que miR-103 y miR-107 se unen directamente a LRP1 (Fig. 6j). Por lo tanto, cotransfectamos imitaciones de miR-103 y miR-107 en EC microvasculares, y luego usamos antagomir (amiR)-103 y amiR-107 para silenciar la regulación positiva inducida por amilina de miR-103 y miR-107. Nuestros resultados muestran que miR-103/107 regula a la baja LRP1 (Fig. 6k), replicando el efecto de la incubación con amilina humana formadora de amiloide (Fig. 5h). AmiR-103/107 rescata la expresión de LRP1 en EC después del estrés celular inducido por amilina (coincubación con amilina humana 10 μM) (Fig. 6l); sin embargo, amiR-103/107 no rescata la expresión de P-gp (Fig. 6m).

Tomados en conjunto, nuestros resultados (Figs. 2-6) sugieren un vínculo potencial entre la amilina pancreática crónicamente desregulada y la salida alterada de Aβ de rata desde el cerebro hacia la circulación sistémica a través de mecanismos que involucran: 1, vasculopatía de amilina que conduce a una vasodilatación cerebral reducida y alteración intersticial. drenaje de fluidos a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos cerebrales; y 2, disfunción endotelial inducida por amilina que conduce a la regulación a la baja de P-gp y LRP1 en la BBB. En ratas HIP, otras causas además de la disminución del transporte, como la alteración de las tasas de degradación de Aβ, el aumento de la agregación que causa el ocultamiento inmunológico de Aβ, el aumento de la entrada de Aβ o el aumento de los niveles sanguíneos de Aβ podrían explicar la disminución de la relación plasma-cerebro para Aβ. .

Estudios previos que utilizaron un ensayo de expresión génica TaqMan encontraron que los genes de microglía tanto proinflamatorios como antiinflamatorios se expresaron diferencialmente (DE) en grupos de ratas HIP frente a WT25. Para predecir posibles patrones moleculares amplios en los genes cerebrales asociados con la exposición crónica a la amilina humana formadora de amiloide pancreático en la sangre, utilizamos análisis de la red de expresión génica y ARN-seq de los genes del hipocampo en ratas macho HIP frente a WT (edad, 15-16 años). -meses). La comparación de los datos de RNAseq de ratas HIP frente a ratas WT (n = 10 machos/grupo) permitió la identificación de 408 transcripciones de genes que se expresaron de forma diferencial (P < 0,05). El rango de magnitud característica del cambio de los genes DE regulados al alza y a la baja se muestra en la Fig. 7a. Los genes DE se anotaron en la base de datos Ingenuity Pathway Analysis (IPA), que identificó el enriquecimiento de múltiples vías canónicas representadas por estos genes (Fig. 7b). Entre los genes DE en ratas HIP en comparación con las ratas WT, 25 genes identificaron el enriquecimiento de las 5 vías canónicas principales, como se muestra en el mapa de calor de agrupación jerárquica de estos genes DE (Fig. 7c). Clasificamos aún más los 408 genes DE según la ontología de genes (GO) mediante el uso de la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID) en procesos biológicos enriquecidos en HIP en comparación con ratas WT (Fig. 7d). Estos resultados (Fig. 7b-d) sugieren que la desregulación de los genes involucrados en las respuestas celulares a la inflamación, el metabolismo alterado y la hipoxia pueden estar asociados con concentraciones de amilina en sangre crónicamente aumentadas, depósito de amilina cerebrovascular y deterioro de la eliminación de Aβ en el cerebro.

a Log10 (valor p) frente a Log10 (cambio de pliegue) de los genes DE en cerebros de rata HIP frente a WT. Cada punto representa un gen, con regulación positiva en color rojo (HIP frente a WT, cambio ≥ 1,5 veces), regulación negativa en color azul (HIP frente a WT, cambio ≥ 1,5 veces) y cambio < 1,5 veces en color negro . b Las 5 vías canónicas principales identificadas por Ingenuity Pathways Analysis de genes expresados ​​diferencialmente (DE) detectados por análisis RNA-seq de tejido hipocampal de los grupos de ratas HIP frente a WT (P < 0,05) (n = 10 machos/grupo). c La agrupación jerárquica de 25 genes DE identificó el enriquecimiento de las 5 vías canónicas principales en (b). d Los 5 principales procesos biológicos de ontología génica (GO) enriquecidos en el grupo de ratas HIP en comparación con el grupo de ratas WT.

Nuestros datos de modelos humanos y animales de laboratorio muestran que un mecanismo potencialmente crítico que permite que se desarrolle la patología cerebral Aβ implica la acumulación cerebrovascular de amilina formadora de amiloide secretada por el páncreas. Debido a que la amilina pancreática contribuye al desarrollo de la DM tipo 2, nuestros resultados sugieren la interacción amilina-Aβ como un posible vínculo molecular faltante entre la DM tipo 2 y la EA, y un nuevo enfoque prometedor para la terapia. Encontramos tres factores interdependientes que parecen ser la base del deterioro inducido por amilina de la eliminación de Aβ en el cerebro: 1, las concentraciones de amilina en sangre aumentan en la demencia frente a las personas sin deterioro cognitivo; 2, el aumento crónico de las concentraciones de amilina formadora de amiloide en la sangre promueve la acumulación de amilina en los monocitos circulantes, lo que refleja la inflamación sistémica y conduce al depósito de amilina cerebrovascular; y 3, el depósito de amilina cerebrovascular perturba el transporte de Aβ mediado por LRP1-Pgp a través de la BBB y la eliminación de Aβ a través del drenaje de líquido intersticial a lo largo de las paredes vasculares, como lo indica la coubicación de amilina-Aβ en las paredes de los vasos sanguíneos y los espacios perivasculares.

La secreción de insulina compensatoria es central para la resistencia a la insulina y coincide con una mayor secreción de amilina8,9,10 (también demostrado por nuestros datos actuales en participantes en una cohorte que abarca el continuo cognitivo desde deterioro cognitivo leve hasta demencia; Fig. 1d). Dado que los pacientes con DM tipo 2 son resistentes a la insulina durante muchos años antes de su diagnóstico clínico, están expuestos a hiperamilinemia crónica que está relacionada con la deposición de amilina amiloide pancreática8,9,10, la activación del inflamasoma NLRP3 y el aumento de la secreción de IL- 1β de macrófagos y células dendríticas11,12,13. Nuestros datos que muestran la amilina absorbida por los monocitos circulantes en asociación con un aumento de las concentraciones plasmáticas de IL-1β indican posibles respuestas inmunitarias innatas al aumento de las concentraciones de amilina formadora de amiloide pancreático en la sangre. Estos datos sugieren que el depósito de amilina cerebrovascular que conduce a la inflamación perivascular puede desarrollarse, al menos en parte, debido a una reacción inmunitaria innata inadecuada a las concentraciones crecientes de amiloide pancreático en la sangre relacionadas con la prediabetes. Los estudios futuros deberían determinar si la modulación de la vía de la amilina-IL-1β podría proporcionar un enfoque para contrarrestar la neuroinflamación en el contexto de la EA.

Los depósitos perivasculares de Aβ son comunes en los cerebros con AD y se han atribuido a un drenaje de líquido intersticial alterado2,3,4. La fuerza motriz del drenaje del líquido intersticial surge de la contracción y relajación espontáneas de las células del músculo liso vascular2,3,4. Nuestros resultados muestran asociaciones entre la inflamación sistémica mediada por amilina y la vasodilatación cerebral reducida y el CBF a través de la desregulación de la arginasa-NO dentro de la pared del vaso. Nuestros datos también muestran que la amilina formadora de amiloide pancreático se acumula en los capilares cerebrales y puede afectar la expresión de P-gp y LRP1, proteínas que median el transporte de Aβ a través de la BBB. Aunque las vías reguladas por APOE/LRP1 tienen un papel bien establecido en la eliminación de Aβ en el cerebro46, la posibilidad de que la amilina del lado luminal del vaso sanguíneo pueda regular a la baja la expresión de LRP1 puede representar un nuevo objetivo terapéutico para reducir la patología de la EA.

En conclusión, nuestros datos sugieren que la detección de la desregulación de la amilina pancreática mediante la medición de la acumulación de amilina en la sangre y los monocitos circulantes podría identificar a las personas con mayor riesgo de patologías cerebrales microvasculares y de EA. Esto también es importante porque la función ejecutiva y la memoria de trabajo deterioradas son comunes en personas con diabetes tipo 2 sin demencia1, y la desregulación de la amilina está asociada con la diabetes tipo 2 y puede ser un posible factor contribuyente a estos efectos clínicos. La DM tipo 2 y la EA, dos amenazas crecientes para la salud mundial, parecen estar vinculadas a través de mecanismos complejos14,47,48,49,50 que posiblemente involucran a la amilina formadora de amiloide como un factor molecular más allá de la desregulación de la glucosa y la insulina. La inflamación cerebrovascular mediada por amilina, el deterioro de la eliminación de Aβ en el cerebro y la expresión génica desregulada en el cerebro aparecen como características biológicas de la hipersecreción pancreática de amilina (prediabetes). Los presentes datos pueden mejorar la comprensión de los mecanismos de la inflamación cerebrovascular y el riesgo de alteración de la eliminación de Aβ del cerebro en el contexto de la resistencia a la insulina prediabética, cuando la concentración de amilina en sangre está crónicamente elevada. La inhibición de la inflamación sistémica y cerebrovascular causada por la amilina formadora de amiloide pancreático podría reducir la desregulación de la arginasa-NO cerebrovascular, la vasoconstricción, las reducciones del flujo sanguíneo y la acumulación de Aβ en el cerebro.

Esta investigación empleó sangre entera anonimizada, plasma y tejido cerebral congelado y fijado en formalina del biobanco del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer de la Universidad de Kentucky (UK-ADRC) bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Kentucky ( IRB). El consentimiento informado se obtuvo de forma prospectiva. Se recolectaron muestras de sangre completa de 83 participantes en una cohorte que abarcó el continuo cognitivo desde sin deterioro cognitivo hasta deterioro cognitivo leve y demencia y se analizaron 80 muestras (todas incluidas en el mismo kit ELISA de amilina). Las mediciones se realizaron por duplicado. Se obtuvieron muestras congeladas de tejido de la corteza temporal de 42 personas con demencia tipo sAD documentada por positividad de amiloide β (Aβ) y 18 individuos sin deterioro cognitivo. Tanto el plasma como el tejido cerebral congelado se obtuvieron de 20 individuos. La corteza frontal dorsolateral fijada con formalina (área 9 de Brodmann) se obtuvo de 32 individuos. En las Tablas 1 y 2 se proporcionan estadísticas resumidas para las personas que proporcionan cada tipo de tejido, incluido el tamaño de la muestra, el estado cognitivo, el sexo, el estado de la diabetes y la edad, junto con información clínica y neuropatológica. La ausencia/presencia de diabetes se determinó durante la vida (en visitas clínicas longitudinales) por autoinforme del paciente o cuidador y el uso de medicamentos para la diabetes. La evaluación de la demencia clínica y las características neuropatológicas, incluidas las placas amiloides neuríticas, el Consorcio para establecer un registro de la enfermedad de Alzheimer (CERAD), el estadio Braak NFT y la gravedad de la angiopatía amiloide cerebral (CAA), se puntuaron de acuerdo con los protocolos publicados27,28,29 ,30,31. Se realizó un análisis IHC secundario del depósito de amilina-Aβ cerebrovascular en un subconjunto de cerebros con fAD (n = 27) con acumulación de amilina documentada a través de IHC y ELISA21. Los tejidos de la corteza temporal fijados con formalina de los portadores de la mutación fAD fueron proporcionados por el Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders en UCL Queen Square Institute of Neurology (Reino Unido) y King's College London (Reino Unido).

Se realizaron análisis ciegos del observador en todas las muestras de tejido humano; los resultados se comunicaron al Centro de AD en la Universidad de Kentucky para evaluar las relaciones con la función cognitiva/patología de AD. Los investigadores también estaban cegados en la puntuación de los análisis histológicos y en las pruebas longitudinales de comportamiento animal para evitar sesgos. No se cegó a los investigadores durante la intervención/inyección farmacológica porque las intervenciones fueron realizadas por el mismo personal. Los investigadores no estaban cegados durante la mayoría de los ensayos bioquímicos porque no es necesario. La recolección de datos se realizó al mismo tiempo para grupos experimentales con el mismo entorno.

Esta investigación se ajusta a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por US National Academies Press (8ª edición, 2011) y fue aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky. Las ratas se alojaron en jaulas ventiladas individualmente, en un ciclo de luz de 12 horas, y recibieron una dieta granulado estándar y agua ad libitum.

Comparamos ratas que desarrollan diabetes tipo 2 vinculada a la expresión de amilina humana formadora de amiloide en el páncreas (ratas macho HIP; n = 84) con ratas de control de tipo salvaje que expresan amilina de rata endógena no amiloidogénica en el páncreas (ratas WT ; n = 52). Se compraron parejas reproductoras de Charles River Laboratory. Para los análisis transversales de amilina y glucosa en sangre, utilizamos ratas HIP de 6 a 8 meses, de 10 a 12 meses y de 15 a 16 meses. Para todos los demás experimentos, usamos ratas de 15 a 16 meses de edad. Además, empleamos ratas APP/PS1/HIP (n = 10 machos; de 15 a 16 meses de edad) para estudiar el impacto de la amilina humana formadora de amiloide pancreático en Aβ cerebrovascular en el contexto de una patología similar a la EA. Se generaron ratas APP/PS1/HIP como se describió previamente21. Brevemente, las ratas TgF344-19 del Rat Resource and Research Center, Univ. de Missouri, Columbia, MO (ratas APP/PS1) son ratas Fischer que expresan el gen de la proteína precursora humana Aβ (A4) (hAPP) con la mutación sueca (K595N/M596L), y el gen de la presenilina 1 (PSEN1) con una deleción del exón 9, impulsada por el promotor de priones de ratón (Prp). Las ratas APP/PS1 se cruzaron con ratas HIP para generar ratas que son triplemente transgénicas para amilina humana, APP y PSEN1 (ratas APP/PS1/HIP). Las ratas APP/PS1 (n = 10 machos; de 15 a 16 meses de edad) que expresan amilina de rata no amiloidogénica sirvieron como controles para los efectos de la amilina humana amiloidogénica. También utilizamos tejidos pancreáticos y cerebrales de ratas knockout para amilina (AKO)21 (n = 3 machos; de 15 a 16 meses de edad) como controles negativos para la expresión de amilina. En el estudio se utilizó un total de n = 159 ratas macho.

Las resonancias magnéticas se realizaron en hermanos de camada HIP y WT utilizando un escáner de resonancia magnética nuclear horizontal de 7 T (ClinScan, Brucker BioSpin MRI, Ettlingen, Alemania)18. Las imágenes coronales ponderadas en T2 se obtuvieron usando parámetros genéricos: campo de visión (FOV) 40 mm, tiempo de repetición (TR) 3000 ms, tiempo de eco (TE) 24 ms, espesor de corte 1 mm, espacio entre cortes 1 mm, 7 cortes . La perfusión cerebral se evaluó utilizando el protocolo ASL publicado35. Las imágenes anatómicas y de perfusión fueron co-registradas y filtradas con las rutinas de la caja de herramientas de ASL. Se definió manualmente una máscara para cada rata para excluir ambos tejidos del exterior del cerebro, ya que el umbral a veces era insuficiente para excluir esos tejidos. También se determinó que los píxeles en el borde del cerebro introdujeron grandes variaciones en los valores de perfusión, presumiblemente debido a efectos parciales de volumen y susceptibilidad, y por lo tanto también fueron excluidos. Los valores de perfusión se determinaron sin saber a qué grupos pertenecían las ratas para evitar sesgos.

Los déficits de las extremidades anteriores de la rata se evaluaron mediante el tiempo de contacto entre las extremidades anteriores y la pared en la prueba del cilindro. La capacidad de equilibrio de la rata se determinó registrando el ángulo en el que el animal comenzó a resbalar en un plano inclinado ascendente. Las anomalías en las patas traseras de la rata se evaluaron puntuando la severidad de la unión de las patas traseras. Para la prueba de rotarod, los animales se aclimataron a la varilla estática 2 días antes de la prueba. El día de la prueba, la velocidad del rotarod aumentó de 0 a 40 rpm en 2 min. Cada rata se probó en el Rotarod durante un total de 4 pruebas por día durante 5 días consecutivos. Para cada día de entrenamiento, se descartó el valor más pequeño de latencia a la caída de cada rata. Se promediaron las lecturas restantes y se calculó un promedio grupal para los grupos HIP y WT. Para los análisis se utilizó el método de puntuación z compuesta21. Para cada prueba de comportamiento, se calcularon la media y la desviación estándar a partir de variables individuales recopiladas de evaluaciones longitudinales de animales en los grupos experimentales. La puntuación Z para cada animal en cada prueba de comportamiento se calculó utilizando la siguiente ecuación:

La puntuación compuesta para cada animal se calculó promediando las puntuaciones z de cada prueba.

Para la inmunohistoquímica, se procesaron tejidos cerebrales de humanos y ratas fijados con formalina e incluidos en parafina utilizando protocolos publicados15,18,21,25,26,34. En resumen, las secciones de tejidos se desparafinizaron en xileno 3 veces durante 5 min. Las secciones se rehidrataron dos veces en diluciones seriadas (100%, 95 y 70%) de alcohol y se lavaron una vez en PBS. Las secciones se incubaron en H2O2 al 3 % (diluido en metanol) durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear la peroxidasa endógena interna. Luego, las secciones se incubaron en tampón de recuperación 1x (S1699; Dako) durante 30 min a 95 °C en un vaporizador para la recuperación del antígeno. Las secciones se enfriaron a temperatura ambiente y se lavaron una vez en PBS 1x. Las secciones se bloquearon durante 1 h en una solución de suero de caballo al 15 % y se lavaron una vez en PBS. Las secciones se incubaron con anticuerpo de amilina durante 24 h. El segundo día, todas las secciones se lavaron 2 veces en TBS 1X. Todas las secciones se incubaron con anticuerpo secundario IgG biotinilado durante 1 hora. Todas las secciones se lavaron nuevamente y se incubaron con complejo ABC durante 30 min. Todas las secciones se lavaron y revelaron en cromógeno AEC. Las secciones se lavaron y bloquearon en NGS al 10 % durante 1 hora. Las secciones se incubaron con el segundo anticuerpo primario durante la noche. El tercer día, todas las secciones se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con AP durante 1 hora. Todas las secciones se lavaron y revelaron en cromógeno Stay-green. Todas las secciones se lavaron y contratiñeron con hematoxilina y se montaron en medios de montaje a base de agua. Anticuerpos contra amilina (1:200; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), GFAP (1:400; 3670S, Cell Signaling Technology), CD68 (1:200; MCA341GA, Biorad), CD11b (1:200; MCA275GA , Biorad,) y Aβ (1:400; clon 6E10, 803002, Biolegend) fueron los anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios fueron IgG conjugada anti-ratón-AP de caballo IMPRESS biotinilada (1:100, A3562, Sigma) e IgG anti-conejo biotinilada (1:300, BA-1100, Vector). La especificidad del anticuerpo contra la amilina en tejidos cerebrales humanos y de rata se estableció en estudios previos15,18,21,25,26,34. El tejido pancreático de ratas AKO fue el control negativo para la amilina.

En los experimentos de inmunofluorescencia, utilizamos tejido cerebral humano incluido en parafina y fijado en formalina procesado utilizando protocolos publicados18,21. En resumen, las secciones de tejido se desparafinizaron en xileno (tres veces, 10 min cada una), se rehidrataron en una dilución en serie de alcohol (100 %, 95 %, 85 %) y se lavaron una vez con PBS 1X. La recuperación del antígeno se realizó en tampón de citrato (1x, S1699; Dako) (calentado durante 30 min a 90 °C). Las secciones se bloquearon en tampón de bloqueo (5 % de NGS, 2 % de BSA y 0,25 % de Triton-X en 1xTBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las secciones se incubaron en una mezcla de anticuerpos primarios durante 24 h a 4 °C. Las secciones se lavaron en una solución de tris-NaCl 1x (tres veces, 5 min cada una). Las secciones se incubaron en una mezcla de anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en tri-NaCl como antes y se incubaron en negro de Sudán al 0,2 % durante 5 min para bloquear la autoinmunofluorescencia. Las secciones se lavaron en PBS 1x tres veces y se montaron en medios de montaje. Se tomaron imágenes de las secciones después de 24 h de montaje. Anti-amilina (1:200; clon E5; SC-377530; Santa Cruz, y 1:200; y T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), Aβ (1:400; clon 6E10, 803002, Biolegend), IL- 1β (1:400; ab9722, Abcam), anti-colágeno IV (1:500; ab6586; abcam), anti-alfa actina de músculo liso-Alexa Fluor 405 (1:200; ab210128, abcam), anti-caveolina-1 (1:100; sc-894; Santa Cruz, TX), anti-LRP1 (1:500; sc-57351; Santa Cruz), anti-4HNE (1:200; ab46545; abcam) fueron los anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios fueron: Alexa Fluor 488 anti-conejo IgG (A11034; Thermo Fisher), Alexa Fluor 488 conjugado anti-ratón IgG (1:300; A11029; Invitrogen), Alexa Fluor 568 conjugado anti-conejo IgG (1:200; A11036 ; Invitrogen) y Alexa Fluor 568 conjugado anti-IgG de ratón (1:300; A11004; Invitrogen). Los núcleos se contrastaron con medio de montaje DAPI. Para la tinción triple de los tejidos del cerebro humano, se añadió el anticuerpo Alexa Fluor 405 de actina de músculo liso después de la tinción para amilina humana y colágeno IV y se utilizó medio de montaje libre de DAPI. Para la tinción con tioflavina S, después de la incubación del anticuerpo secundario, se incubaron portaobjetos de cerebro en 0,5 % de tioflavina S durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, los portaobjetos se incubaron durante 3 minutos en etanol al 70 %, 5 minutos en negro de Sudán al 0,2 % antes de lavarlos y montarlos.

Para los análisis IHC, las señales de intensidad de inmunorreactividad para cada anticuerpo (amilina, Aβ) se desconvolucionaron y analizaron mediante el complemento Color Deconvolution en ImageJ. Se establecieron la determinación del vector (perfil RGB) y el umbral para cada color de interés usando imágenes de la tinción única (es decir, el control positivo para cada anticuerpo analizado). El umbral en cada imagen se estableció para minimizar visualmente el fondo. El perfil RGB y el umbral establecidos se aplicaron a un comando de secuencia de comandos macro. Se aplicó el comando macroscript a los grupos experimentales y se midió el porcentaje de área positiva para el color de interés. Para la deposición cerebrovascular estimada de amilina-Aβ, se contaron los vasos sanguíneos claramente definidos que eran positivos para amilina, Aβ o ambos. El número de recuentos de vasos sanguíneos se normalizó con respecto al área total de imágenes.

Los capilares cerebrales recién aislados se tiñeron para el STORM usando anticuerpos primarios (anti-amilina humana; T-4157; Peninsula Laboratories y anti-glicoforina A; sc-71159 Santa Cruz biotech) y anticuerpos secundarios (conejo IgG-atto 647 e ratón IgG- atto 488) de la siguiente manera: Los platos de 35 mm con fondo de vidrio (P35G-0.170-14-C, MatTek Corporation) se limpiaron con KOH 1 M durante 15 min en un sonicador, se enjuagaron con agua Milli-Q y se esterilizaron al menos 30 min bajo luz ultravioleta . Los capilares cerebrales recién aislados se sembraron en las placas anteriores durante 30 min a temperatura ambiente y se lavaron con 500 µl de PBS 1X. Los capilares se fijaron con 200 µl de PFA al 3 % + glutaraldehído al 0,1 % durante 10 min a temperatura ambiente y se redujeron con 200 µl de NaBH4 al 0,1 % durante 7 min a temperatura ambiente. Los capilares se lavaron con PBS tres veces y se bloquearon con 200 µl de tampón de bloqueo (BSA al 3 % + Triton X-100 al 0,2 % en PBS) durante 120 min a temperatura ambiente en el balancín. Luego, se agregaron 200 µl del cóctel de anticuerpos primarios durante 60 min a temperatura ambiente en el balancín y se lavaron cinco veces con 200 µl de tampón de lavado (BSA al 0,2 % + Triton X-100 al 0,05 % en PBS) durante 15 min por lavado a temperatura ambiente. en la mecedora. Después de lavar, se añadieron 150 µl del cóctel de anticuerpos secundarios durante 30 min a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con 200 µl de tampón de lavado durante 10 min cada lavado en el balancín. Los capilares se fijaron posteriormente con 200 µl de PFA al 3 % + glutaraldehído al 0,1 % durante 10 min a temperatura ambiente y se almacenaron en 500 µl de PBS y se mantuvieron en tampón de imágenes STORM [7 µl de GLOX (captador de oxígeno) y 70 µl de MEA (clorhidrato de cisteamina) + 620 l de tampón B (Tris-HCL/NaCl)] durante la obtención de imágenes utilizando un microscopio Nikon N-SIM N-STORM (Nikon).

Se rehidrataron secciones de cerebro fijadas en formalina e incluidas en parafina (10 μm) y se pretrataron con ácido fórmico al 95 % durante 3 min a temperatura ambiente para exponer los antígenos. Después de enjuagar en 50 mmol/L de tampón Tris-HCl con 150 mmol/L de NaCl (pH 7,4), las secciones de cerebro se incubaron con anticuerpos primarios anti-amilina humana (anti-amilina humana; T-4157; Peninsula Laboratories) y anticuerpos anti-amilina humana de ratón. -Anticuerpo Aβ 6E10 (803002, Biolegend) durante la noche a 4 °C. Duolink in situ PLA (Duolink In situ PLA, DUO92004, Sigma, EE. UU.) se realizó de acuerdo con el protocolo publicado26. Brevemente, para la detección de pares de anticuerpos primarios, las secciones se incubaron durante 90 minutos con IgG MINUS anti-ratón conjugado con oligonucleótido y IgG PLUS anti-conejo (sondas PLA) diluidas 1:6 en solución salina tamponada con Tris a 37 °C. Las cadenas de ADN amplificadas se detectaron con oligonucleótidos conjugados con un fluoróforo y los núcleos se tiñeron con colorante Hoechst.

Cada muestra de sangre (100 µl) se incubó con una mezcla de anticuerpos primarios CD14 (Abcam, ab203294, 1:400) y amilina humana (Santa Cruz, SC-377530, 1:100) durante 30 min a temperatura ambiente. La sangre se lisó en 2 ml de tampón de lisis (solución de lisis BD 1x, n.° de catálogo 349202, BD Biosciences) durante 5 min y se lavó en PBS 1x con suero bovino fetal al 4 % (FCS). Las células restantes después del lavado se incubaron en anticuerpos secundarios durante 30 min a temperatura ambiente, luego se lavaron y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS 1x con FCS al 4%. Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti ratón de cabra Alexa Fluor 488 (H + L) (n.º de cat. A11029; Invitrogen, dilución 1:200 en 1xPBS con FBS al 4 %) para amilina humana y Alexa Fluor 568 anti-ratón de cabra (n.º de cat. A11004). , Invitrogen, dilución 1:200, en 1xPBS con 4% FBS), para CD14, respectivamente. El análisis de flujo se realizó en citómetros BD Symphony A3. Las células restantes se bloquearon en SSC-A frente a FSC-A para determinar las poblaciones de células vivas. Los dobletes (células agregadas) se separaron utilizando FSC-H frente a FSC-A. Las células no agregadas se controlaron adicionalmente para seleccionar monocitos que eran positivos para CD14 y/o amilina humana. Se usaron control negativo (sin anticuerpo) y control positivo (monocitos humanos) para establecer los límites superior e inferior (Figura complementaria S4).

Los datos se adquirieron usando BDFacsDiva y se analizaron usando el software FlowJo v10.

Se homogeneizaron tejidos cerebrales humanos congelados en tampón homogeneizado (NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, NaF 50 mM, Triton X-100 al 2 %, SDS al 0,1 %, inhibidores de proteasa y fosfatasa al 1 % (v/v), pH 7,5) . Los homogeneizados se centrifugaron a 17 000 × g durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante se separó del sedimento después de la centrifugación y luego se usó para todos los experimentos. Las muestras de cerebro de rata congeladas se homogeneizaron con tampón Triton al 1 % (25 veces el volumen del tejido) que contenía Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1 % (v/v), 1 % (v/v) inhibidores de proteasa y fosfatasa, pH 7,5. Los homogeneizados se dejaron en hielo durante 15 min. Los homogeneizados se centrifugaron a 22 000 × g durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante (fracción soluble en Tritón) se separó del sedimento y se usó para todos los experimentos.

Amylin ELISA (EZHA-52K, Millipore Sigma) se utilizó para medir las concentraciones de amilina en lisados ​​de sangre entera, plasma, lisados ​​capilares y homogeneizados de cerebro. La concentración de insulina se midió en lisados ​​de sangre entera usando un kit ELISA sándwich (AYQ-E10465, solución de ensayo). Las concentraciones de Aβ42 en homogeneizados de cerebro se midieron utilizando el kit ELISA tipo sándwich para Aβ42 (Thermo Fisher Scientific, n.° de cat. KHB3441). Se usaron ELISA para IL-1β (ab255730, abcam), arginasa 1 (MBS289817, MyBioSource) y arginasa 2 (MBS7216305, MyBioSource) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las concentraciones de proteínas diana se normalizaron con respecto a la cantidad de entrada de proteína total evaluada utilizando el método BCA.

La actividad de la arginasa se midió en lisados ​​​​de microvasos cerebrales mediante un ensayo colorimétrico (MAK112, Sigma, MO, EE. UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo publicado34. Brevemente, las muestras se incubaron con 10 µl de tampón sustrato 5X durante 2 ha 37 °C. No se añadió sustrato a los pocillos de muestra en blanco. Para detener la reacción de la arginasa se añadieron a cada pocillo 200 µl del reactivo Urea (estándar de urea, agua, muestras y muestra en blanco). A continuación, se añadieron 10 µl de tampón de sustrato 5X a los pocillos de muestra en blanco y se incubaron a 37 °C durante 60 min. La lectura de absorbancia se tomó a 430 nm. La actividad de arginasa se calculó en base a las instrucciones de análisis del fabricante.

El ensayo de nitrito (M36051, Molecular probes) y el ensayo de nitrato (ab65328, Abcam) de muestras de plasma de rata se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, para el ensayo de nitrito, los primeros 100 µl de reactivo de cuantificación de nitrito de trabajo se cargaron en una microplaca y luego se agregaron 10 µl de muestras de plasma y estándar de nitrito por duplicado. La microplaca se incubó durante 10 min a temperatura ambiente y luego se añadieron 5 µl de revelador de cuantificación de nitrito a cada pocillo. Después de un desarrollo de color óptimo, se midieron las intensidades de fluorescencia a 365/450 nm (excitación/emisión). Para el ensayo de nitrato, los primeros 85 µl de estándares de nitrato y 85 ul de muestras de plasma se cargaron en microplaca por duplicado, luego se agregaron 5 µl de nitrato reductasa y 5 µl de cofactor enzimático a cada estándar y pocillo de muestra. La placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 5 µl de potenciador a cada estándar y muestras seguidas de 50 µl de reactivo de Griess R1 y R2. Las intensidades de salida se midieron en un lector de microplacas a 540 nm.

Los capilares cerebrales se aislaron de cerebros de rata utilizando el protocolo publicado18. Los cerebros se homogeneizaron en PBS enfriado con hielo y se mezclaron con una solución de Ficoll al 30% invirtiendo suavemente los tubos y luego se centrifugaron a 5800 × g durante 20 min a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en PBS enfriado con hielo con BSA al 1 % y se pasaron a través de la columna de perlas de vidrio. Las perlas se agitaron en PBS con PBS al 1 % utilizando una pipeta de 25 ml y las soluciones se dividieron por igual en dos tubos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron y los sedimentos se disolvieron en 0,5 a 1 ml de PBS y se usaron para los experimentos.

Se extirparon las arterias del cerebro medio, se limpiaron de tejido conjuntivo y se colocaron en tampón de digestión que contenía (en mmol/L) 130 NaCl, 1 KCl, 0,2 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 3 piruvato, 25 HEPES y 22 glucosa (ajustado al pH). 7.4 con NaOH). A continuación, las arterias se incubaron durante 15 min a 37 °C en tampón de digestión suplementado con papaína (0,5 mg/ml) y ditiotreitol (1 mg/ml) seguido de una segunda incubación (15 min a 37 °C) en tampón de digestión suplementado con Sigma colagenasas Tipo F y Tipo H (1 mg/mL cada una). A continuación, las arterias se lavaron con tampón de digestión y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos, después de lo cual se agitó suavemente con una pipeta Pasteur pulida al fuego para crear una suspensión celular.

El tono arterial se midió en arterias piales y cerebrales posteriores recién aisladas utilizando un sistema IonOptix Vessel Diameter y un protocolo publicado36. Brevemente, las arterias se aislaron de un cerebro de rata fresco y se diseccionaron sin tejidos conectivos. Las ramas se amarraron en HEPES-PSS (NaCl 141,9 mM, KCL 4,7 mM, MgSO4 1,7 mM, EDTA 0,5 mM, CaCl2 2,8 mM, HEPES 10 mM, KH2PO4 1,2 mM y glucosa 5 mM). Se canuló un extremo de la arteria con una micropipeta dentro de la cámara experimental del miógrafo y el otro extremo se cerró a ciegas. La ausencia de fugas se verificó manteniendo una presión estable. Inicialmente la presión intraluminal se mantuvo en 10 mmHg durante 15 min, luego se aumentó la presión intraluminal de 20 a 60 mmHg (20 mmHg→40 mmHg→ 60 mmHg→80 mmHg-→100 mmHg-→120 mmHg) estimulando el desarrollo del tono arterial. El diámetro estable después de cada aumento de la presión intravascular se registró como diámetro activo. A continuación, se reemplazó HEPES-PSS con calcio 0 y EGTA 2 mM para determinar el diámetro pasivo arterial. La presión intraluminal se redujo en la dirección opuesta y se registró el diámetro pasivo máximo para cada punto de presión. El tono arterial se calculó utilizando la siguiente fórmula: Tono arterial = ((diámetro pasivo-diámetro activo)/diámetro pasivo) *100).

Para inmunoprecipitar Aβ a partir de homogeneizados de cerebro y plasma, se utilizó un protocolo publicado21. Brevemente, se incubó 1 mg de proteína con Aβ anti-rata (2 µg; CST2454; Cell Signaling Technology) durante la noche con rotación de extremo a extremo, a 4 °C. El complejo antígeno-anticuerpo se añadió a la suspensión de resina de proteína A/G inmovilizada durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavó y las muestras se eluyeron de las resinas utilizando un tampón de elución. El eluato se usó para el análisis de transferencia Western. Amersham ECL Rabbit IgG, Ab completo ligado a HRP (de burro) (Cytive, Cat# NA934V-HRP), contra IgG de cadena ligera y pesada, fue el anticuerpo secundario (dilución 1:20,000).

El análisis de transferencia Western se realizó en capilares cerebrales aislados, homogeneizado de tejido cerebral y plasma de ratas utilizando protocolos publicados15,18,21,25,26,34. Se usó tampón RIPA con SDS al 2 % para recuperar monómeros Aβ de muestras de cerebro congeladas. El lisado se centrifugó a 17.000 × g durante 30 min. El sobrenadante se separó del sedimento después de la centrifugación y luego se usó para transferencia Western. Los niveles de proteína total se estimaron usando un kit BCA (23225, ThermoFisher). Anticuerpo anti-LRP1 que reconoce la subunidad β de LRP1 (1:1.000; clon 5A6; sc-57351; Santa Cruz), anti-P-glucoproteína o Pgp (1:1000, ab170904, Abcam), anti-amilina policlonal de conejo ( 1:2000; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories, CA), Aβ anti-rata y humano (1:1,000; 2454; Cell Signaling Technology), actina anti-β de ratón (1:10,000; clon BA3R; MA5-15739 ; Thermo-Fisher), anti-GAPDH monoclonal de ratón (1:10.000; clon 6C5; ab8245; Abcam), conjugado anti-IgG HRP de conejo (1:30.000; NA934VS; GE Healthcare) y conjugado anti-IgG HRP de ratón (1: 20,000; NXA931; GE Healthcare) fueron anticuerpos primarios. Aβ de rata inmunoprecipitado de homogeneizados de cerebro y plasma emparejado (50 µg de proteína de homogeneizado de tejido o elución de Aβ de rata inmunoprecipitado) se cargaron en geles SDS-PAGE al 8%. El Aβ agregado de homogeneizados de cerebro se resolvió en PAGE nativo (no reductor; no desnaturalizado). Los péptidos Aβ monoméricos se resolvieron en geles Bis-Tris ácidos con urea 8 M. Para mejorar la señal de Aβ monomérico, las membranas se hirvieron durante 3 min en PBS antes del paso de bloqueo. LRP1 en lisados ​​capilares de células y cerebro se resolvió utilizando gel Bis-Tris al 4-12 % en condiciones no reductoras. Anti-conejo o anti-ratón conjugados con HRP fueron anticuerpos secundarios. Se verificó la igualdad de carga en los experimentos de transferencia Western volviendo a sondear con un anticuerpo monoclonal anti-actina β (criado en ratón, clon BA3R, Thermo Scientific; 1:2000). Los niveles de proteína se compararon mediante análisis densitométrico utilizando el software ImageJ. Se realizaron experimentos de control negativo para probar la especificidad de las bandas identificadas en la transferencia de Western después de la inmunoprecipitación (Fig. 5b). Brevemente, se usaron muestras duplicadas de homogeneizado de cerebro y plasma (1 mg de proteína total) para la inmunoprecipitación con: 1, anticuerpo anti-Aβ (CST2454; Cell Signaling Technology); y 2, anticuerpo anti-IgG (Cytive, Cat# NA934V-HRP). Después de la transferencia y el bloqueo, ambas membranas se incubaron con el anticuerpo anti-Aβ y se analizaron y tomaron imágenes juntas. Los resultados muestran intensidades de señal de inmunorreactividad nulas o menores en el conjunto de muestras inmunoprecipitadas con IgG (Figura complementaria S5), lo que demuestra la especificidad del anticuerpo Aβ.

El péptido de amilina humana amidado liofilizado (Anaspec #AS-60254-1) se disolvió en PBS pH 7,4 a la concentración de 50 µM. La mezcla se incubó a 37 °C durante 72 h con agitación ocasional para permitir que la amilina formara agregados. Se inyectó solución de amilina humana agregada en ratas AKO de 9 a 10 meses de edad a través de la vena de la cola (60 µg/kg) (n = 3 ratas macho), diariamente a través de la vena de la cola durante 1 semana.

Utilizamos un modelo BBB in vitro con depósito de amilina en la monocapa de EC y los efectos consiguientes en el transporte de Aβ a través de la monocapa de EC. Brevemente, las células endoteliales microvasculares primarias de cerebro de rata (Cell Applications Inc) se sembraron en insertos Transwell-Clear de 24 pocillos con una membrana de policarbonato de poro de 0,4 μm (Costar, Corning, NY, EE. UU.) y los astrocitos primarios de cerebro de rata (Sigma) se cultivaron en el pozos de fondo. La integridad de la barrera se midió a partir de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) utilizando el medidor EVOM2 con electrodos STX-3 (World Precision Instruments). El TEER máximo se logró dentro de los 8 a 10 días en cultivo. Las permeabilidades de BBB a la amilina humana (10 μM; Anaspec; AS-60254-1), amilina de rata (10 μM; péptido americano) y DMSO (1 mM; vehículo) se evaluaron utilizando FITC-Dextrano 4 kDa (Fisher Scientific) diluido en solución de Hank. Tampón de solución salina equilibrada (HBSS) con BSA al 0,1 % (HBSS-BSA) como marcador de difusión paracelular. Los coeficientes de permeabilidad se calcularon utilizando la fórmula; P = (ΔQ/Δt)/(A*C0), (ΔQ/Δt) = tasa de cambio de FITC-Dextrano; A = área superficial del inserto (0,33 cm2); C0 = Entrada inicial de FITC-Dextrano.

En los experimentos de transcitosis de Aβ42, la monocapa de EC se incubó con amilina humana (10 μM) o vehículo (DMSO) durante 24 h. Después del lavado, la cámara luminal se reemplazó con HBSS-BSA y la cámara abluminal con Aβ(1–42)-FAM (5 µM; Bachem) o FITC-Dextrano, respectivamente. Se recolectaron muestras de Aβ(1–42) de la cámara luminal para medir las intensidades de fluorescencia de Aβ(1–42) − FAM y FITC-Dextrano y el cociente de transcitosis (TQ) de Aβ(1–42) como se describió anteriormente [38] : TQ = (Aβ(1–42) − FAM luminal /Aβ(1–42) − FAM entrada)/(FITC-Dextrano luminal − FITC-Dextrano entrada).

CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega) se utilizó para evaluar la citotoxicidad de la amilina humana formadora de amiloide en la monocapa de EC.

El ARN total se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN total acuoso de ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, AM1914). La síntesis y la amplificación del ADNc se realizaron con el kit iTaq Universal SYBR Green One-Step (Biorad; 1725151) con las siguientes secuencias de cebadores: LRP1: adelante (Fwd) 5ˊ-TTGTGCTGAGCCAAGACATC-3ˊ, inverso (Rev) 5ˊ-GGCGTGGAAGACATGTAGGT-3ˊ; y GAPDH: Fwd 5ˊ-GCTGCGTTTTACACCCTTTC-3ˊ, Rev 5ˊ-GTTTGCTCCAACCAACTGC-3ˊ (IDT, Inc, EE. UU.). Para la cuantificación de miARN, se sintetizó ADNc a partir de ARN total usando el kit de síntesis de ADNc de miARN con poli (A) polimerasa (ABMgood, G902). El cDNA se amplificó usando SYBR Green mastermix (Biorad) junto con cebadores específicos de miRNA de (rno-miR-103-3p, MPR00332; rno-miR-107-3p, MPR00335; RNU6 house Keeping gene, MP-r99998) (ABMgood). Los datos se analizaron utilizando el método 2−ΔΔCt y los experimentos se normalizaron a GAPDH o U6 miRNA.

Para estudiar el papel de la señalización de miARN en la supresión inducida por amilina de la expresión de LRP1 endotelial, utilizamos la transfección de CE microvasculares de cerebro de rata con miR-103–3p (MCR01039), miR-107-3p (MCR01045) y miméticos de control (MCH00000) ( ABMbueno). Antagomir miR-103-3p (IH-320345-05-0005), miR-107-3p (IH-320348-05-0005) y el control negativo (IN-001005-01-05) (Dharmacon Inc.) se utilizaron en un intento de rescatar la expresión de LRP1. Todas las transfecciones se realizaron utilizando RNAiMAX (Invitrogen) según el protocolo recomendado por el fabricante. Brevemente, las EC se colocaron en placas con una confluencia del 50 % en placas de seis pocillos, seguido de una transfección conjunta con 100 nM de 103-3p y 107-3p miméticos o antagonistas junto con sus respectivos controles negativos. Después de 12 h, los grupos de células tratadas con antagomir se trataron adicionalmente con amilina humana 10 μM durante 24 h. Después de 36 h de transfección, las células se recogieron para análisis de transferencia Western.

La amilina humana liofilizada (arriba) se reconstituyó en Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) a 100 µM. Se realizaron diferentes concentraciones con Tris-HCl. En cada punto de tiempo, se añadieron 50 µl de cada uno en una placa de 96 pocillos con 50 µl de 0,016 mg/ml (50,17 mM) de tioflavina T (Sigma). Los glóbulos rojos (RBC) se diluyeron 1:10 con PBS. En cada pocillo, se añadieron 50 µL de RBC/capilar diluido. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de 0,016 mg/ml de ThioT (preparada en PBS). Se midió la fluorescencia a 437 nm de excitación y 485 nm de emisión. La concentración final de ThioT optimizada para la detección de intensidad de señal fue de 50 µM. Los resultados se normalizaron a la entrada de proteína total (RFU/µg- Unidad de Fluorescencia Relativa/µg). Los datos se muestran como cambios de veces en comparación con las ratas WT (o APP/PS1) porque el experimento no es una prueba cuantitativa (no hay estándares de péptidos).

La peroxidación de lípidos se midió en células musculares lisas aisladas y CE microvasculares de cerebro de rata cultivadas utilizando el protocolo publicado51. En resumen, las células se incubaron con la sonda fluorescente ácido 4,4-difluoro-5-(4-fenil-1,3-butadienil)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-undecanoico (C11 -BODIPY581/591; D3861; Invitrogen; OR) y Liperfluo durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la tinción, las células se lavaron cuatro veces y se analizaron con un microscopio de fluorescencia.

Se analizó la expresión diferencial a nivel de genes entre ratas HIP y WT (n = 10 machos/grupo) para probar si los genes cerebrales responden directamente a la inflamación cerebrovascular mediada por amilina después del desarrollo de depósitos de amilina cerebrovascular. El ARN de la corteza cerebral se aisló usando el Mini Kit RNeasy de Qiagen (Ref # 74104). Omega Bioservices realizó preparaciones de bibliotecas de RNAseq y secuenciación con Illumina HiSeq 2500. Los datos de RNAseq se analizaron con el software PartekFlow (Partek, MO). Brevemente, los archivos RNAseq fastq se importaron, se alinearon con el genoma de referencia de rata (Rattus norvegicus-rn7) y se cuantificaron a nivel de gen utilizando la anotación Ensembl105. Los recuentos de lectura de RNAseq se normalizaron y se analizaron más para determinar la expresión diferencial de genes entre los grupos HIP y WT utilizando el algoritmo DESeq2. La abundancia de transcritos de ARN de 403 genes tenía valores de P ≤ 0,05 entre los grupos HIP y WT. Estos genes expresados ​​​​diferencialmente (DE) se consultaron para un enriquecimiento de las vías canónicas utilizando el software Ingenuity Pathway Analyzes (IPA, Qiagen) y además para el enriquecimiento en los procesos biológicos de ontología génica (GO) de estos genes DE utilizando DAVID (NIH).

El número de muestras o animales en cada análisis, el análisis estadístico realizado y los valores de P se informan en figuras y leyendas de figuras. El tamaño de la muestra para el estudio del comportamiento animal se determinó en base a un estudio piloto. El tamaño de la muestra se calculó utilizando Excel con desviación estándar conocida, intervalo confidencial del 95% y alfa igual a 0,05. Se utilizó la prueba de D'Agostino-Pearson y Kolmogorov-Smirnov para probar la distribución de normalidad de las variables continuas. Las comparaciones paramétricas de variables continuas con distribuciones normales se realizaron mediante la prueba t no pareada de dos colas. La corrección de Welch se usó con la prueba t para tener en cuenta la varianza desigual de tamaños de muestra desiguales, si fuera necesario. Las comparaciones paramétricas de tres grupos o más medias grupales se realizaron utilizando ANOVA de una o dos vías con la prueba posterior de Bonferroni. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional de Kruskal-Wallis para los análisis de variables continuas con distribuciones sesgadas y una distribución similar entre los grupos (como en la Fig. S1a complementaria). Las relaciones entre dos variables continuas se analizaron mediante análisis de correlación. Los datos se presentan como media ± SEM o como diagramas de caja y bigotes. La diferencia entre los grupos se consideró significativa cuando P < 0,05. Todos los análisis se realizaron con GraphPad Prism 8.1.

La replicación se realizó en diferentes momentos para verificar la reproducibilidad de la fecha obtenida. Dos miembros diferentes del equipo realizaron ELISA y Western blot por duplicado. Los datos fueron reproducibles tras la replicación. Se realizaron análisis ciegos del observador en todas las muestras de tejido humano; los resultados se comunicaron al Centro de AD de la Universidad de Kentucky para evaluar las relaciones con la función cognitiva/patología de AD. Los investigadores también estaban cegados en la puntuación de los análisis histológicos y en las pruebas longitudinales de comportamiento animal para evitar sesgos. Los investigadores no estaban cegados durante la intervención farmacológica (como los tratamientos con amiR de células EC) o la inyección (amilina humana en ratas AKO) porque las intervenciones fueron realizadas por el mismo personal. Los investigadores no estaban cegados durante la mayoría de los ensayos bioquímicos porque no es necesario. La recolección de datos se realizó al mismo tiempo para grupos experimentales con el mismo entorno.

Todos los anticuerpos utilizados en este manuscrito están bien establecidos por los fabricantes y otras publicaciones. Realizamos la validación del anticuerpo contra la amilina en este estudio.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles dentro del artículo y sus archivos de información complementaria. Los gráficos subyacentes de los datos de origen están disponibles como archivos de 'Cifras de datos suplementarios'. Las imágenes de bot sin recortar y sin editar están disponibles en la Fig. 6 complementaria. Los datos de origen para todas las figuras se proporcionan en un solo archivo de Excel como 'Datos complementarios 1'. Los datos de RNAseq analizados en esta publicación se han depositado en Gene Expression Omnibus del NCBI y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la serie GEO GSE221450.

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Financiado en parte por: Alianza de investigación de la Universidad de Kentucky para reducir la disfunción microvascular asociada a la diabetes (ADAM) e Institutos Nacionales de Salud R01 NS116058, R01 AG057290, R01 AG053999, R01 HL 149127 y P30 AG028383, y la Asociación de Alzheimer VMF-15-363458. Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido, que recibe su financiación de DRI Ltd, financiado por: el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido, la Sociedad de Alzheimer y la Investigación de Alzheimer del Reino Unido; Consejo de Investigación Médica (número de premio MR/N026004/1); Wellcome Trust Hardy (número de premio 202903/Z/16/Z); Fondo familiar Dolby; Instituto Nacional de Investigación en Salud University College London Hospitals Centro de Investigación Biomédica; BRCNIHR Centro de Investigación Biomédica en University College London Hospitals NHS Foundation Trust y University College London. HL recibió el apoyo de una beca de la American Heart Association (18PRE33990154). TL cuenta con el apoyo de una beca senior de Alzheimer's Research UK. HZ es un becario de Wallenberg apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación (#2018-02532), el Consejo Europeo de Investigación (#681712 y #101053962), el Apoyo Estatal Sueco para la Investigación Clínica (#ALFGBG-71320), la Alzheimer Drug Discovery Foundation (ADDF), EE. UU. (#201809-2016862), el Fondo Estratégico de AD y la Asociación de Alzheimer (#ADSF-21-831376-C, #ADSF-21-831381-C y #ADSF-21-831377-C), el Olav Thon Foundation, Erling-Persson Family Foundation, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Hjärnfonden, Suecia (#FO2019-0228), el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 860197 (MIRIADE), el Programa Conjunto de la Unión Europea - Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas (JPND2021-00694) y el Instituto de Investigación de Demencia del Reino Unido en UCL (UKDRI-1003).

Estos autores contribuyeron igualmente: Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan.

Departamento de Farmacología y Ciencias de la Nutrición, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan, Edric Winford, Han Coburn, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa, Kuey C. Chen y Florin Despa

El Centro de Investigación para el Metabolismo Saludable, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Nirmal Verma, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa y Florin Despa

Departamento de Neurociencia, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Edric Winford y Florin Despa

Laboratorio de Genómica UKHC, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Kuey C Chen

Centro Sanders-Brown sobre el Envejecimiento, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Linda J. Van Eldik, Peter T. Nelson, Donna M. Wilcock y Gregory A. Jicha

Departamento de Fisiología, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

donna m wilcock

Departamento de Neurología, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

Gregory A. Jicha, Ann M. Stowe, Larry B. Goldstein y Florin Despa

Centro de Espectroscopía y Imágenes por Resonancia Magnética, Universidad de Kentucky, Lexington, KY, EE. UU.

David K ​​Powell

Instalación de RMN, Universidad de California, Davis, CA, EE. UU.

Jeffrey H Walton

Departamento de Farmacología, Universidad de California, Davis, CA, EE. UU.

Manuel F. Lanzadera

Departamento de Medicina, Universidad de Louisville, Louisville, KY, EE. UU.

Mateo A. Nystoriak

Departamento de Fisiología, Desarrollo y Neurociencia, Universidad de Cambridge, Cambridge, CB2 3EG, Reino Unido

Andrés J. Murray

Departamento de Neurología, Centro Médico Universitario de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

Geert-Jan Biessels

Departamento de Neurociencia Básica y Clínica, King's College London, Londres, Reino Unido

claire troakes

Departamento de Psiquiatría y Neuroquímica, Instituto de Neurociencia y Fisiología, Academia Sahlgrenska de la Universidad de Gotemburgo, Mölndal, Suecia

henrik zetterberg

Laboratorio de Neuroquímica Clínica, Hospital Universitario Sahlgrenska, Mölndal, Suecia

henrik zetterberg

Departamento de Enfermedades Neurodegenerativas, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, Londres, WC1N 3BG, Reino Unido

Henrik Zetterberg, John Hardy y Tammaryn Lashley

Instituto de Investigación de Demencia del Reino Unido en UCL y Departamento de Enfermedades Neurodegenerativas, Instituto de Neurología de UCL, University College London, Londres, Reino Unido

Henrik Zetterberg y John Hardy

Instituto Reta Lila Weston, UCL Queen Square Institute of Neurology, 1 Wakefield Street, Londres, WC1N 1PJ, Reino Unido

Juan Hardy

Centro de Trastornos del Movimiento UCL, University College London, Londres, Reino Unido

Juan Hardy

Instituto de Estudios Avanzados, Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong, RAE de Hong Kong, China

Juan Hardy

Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders, Departamento de Neurociencia Clínica y del Movimiento, UCL Queen Square Institute of Neurology, Londres, Reino Unido

Tammaryn Lashley

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NV: inmunohistoquímica, citometría de flujo, microscopía confocal, STORM, aislamiento de arterias y capilares cerebrales; GVV: análisis de transferencia Western LRP1 y experimentos BBB in vitro; EW: citometría de flujo y procesamiento de tejido cerebral para análisis de RNAseq; DK, NL y LR: genotipificación de ratas, recolección y procesamiento de tejidos, ELISA; HC – comportamiento de rata, ensayo Th-T en sangre de rata; DKP y JHW: experimentos de MRI y ASL; KCC: análisis de datos de RNAseq; SD: aislamiento de SMC y análisis de microscopía confocal del estrés oxidativo en SMC aisladas; AMS: capacitación en citometría de flujo de EW y análisis de datos de citometría de flujo; LVE – protocolo experimental de neuroinflamación; AJM – protocolo experimental de regulación de la arginasa vascular-NO; MFN y MAN - experimentos de miografía de presión; GAJ, PTN, DMW, LVE, HZ, CT, TL y JH: muestras humanas proporcionadas; GAJ, LGB, PTN, JH, HZ, TL, GJB y FD: interpretación de la patología de amilina-Aβ; FD: conceptualización, recursos, análisis de datos y redacción del manuscrito, todos los demás autores contribuyeron a la forma final del manuscrito.

Correspondencia a Florin Despa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Chengbiao Wu y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de Manejo Principal: Joao Valente. Los informes de los revisores están disponibles.

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Verma, N., Velmurugan, GV, Winford, E. et al. Deterioro del flujo de salida de Aβ e inflamación relacionados con la acumulación cerebrovascular de amilina formadora de amiloide secretada por el páncreas. Comun Biol 6, 2 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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Recibido: 08 julio 2022

Aceptado: 21 de diciembre de 2022

Publicado: 03 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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