La levadura de fisión Srr1 y Skb1 promueven la formación de isocromosomas en el centrómero

Apr 11, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 551 (2023) Citar este artículo

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Rad51 mantiene la integridad del genoma, mientras que Rad52 provoca una recombinación homóloga no canónica que conduce a reordenamientos cromosómicos macroscópicos (GCR). Aquí encontramos que la levadura de fisión Srr1/Ber1 y Skb1/PRMT5 promueven los GCR en los centrómeros. Los análisis genéticos y físicos muestran que las mutaciones srr1 y skb1 reducen la formación de isocromosomas mediada por repeticiones invertidas del centrómero. srr1 aumenta la sensibilidad al daño del ADN en las células rad51 pero no elimina la respuesta del punto de control, lo que sugiere que Srr1 promueve la reparación del ADN independiente de Rad51. srr1 y rad52 de forma aditiva, mientras que skb1 y rad52 reducen epistáticamente los GCR. A diferencia de srr1 o rad52, skb1 no aumenta la sensibilidad al daño. Skb1 regula la morfología celular y el ciclo celular con Slf1 y Pom1, respectivamente, pero ni Slf1 ni Pom1 causan GCR. La mutación de residuos conservados en el dominio de arginina metiltransferasa de Skb1 reduce en gran medida los GCR. Estos resultados sugieren que, a través de la metilación de la arginina, Skb1 forma estructuras de ADN aberrantes que conducen a GCR dependientes de Rad52. Este estudio ha descubierto roles para Srr1 y Skb1 en GCR en centrómeros.

Los reordenamientos cromosómicos macroscópicos (GCR), como las translocaciones, pueden ocurrir usando secuencias repetitivas que son abundantes y están muy extendidas en los genomas eucarióticos1. En humanos, el número total de secuencias repetitivas, incluidas las repeticiones satélite y los elementos transponibles, representa el 54 % del genoma2,3. Los GCR causan muerte celular y trastornos genéticos, incluido el cáncer. Por otro lado, los GCR pueden ser una fuerza impulsora de la evolución al crear diversidad genómica4. Por lo tanto, los GCR no son solo fenómenos patológicos sino también fisiológicos.

El centrómero que asegura la segregación cromosómica adecuada contiene secuencias de ADN repetitivas en muchos eucariotas. Los centrómeros humanos (≥ 3 Mb) contienen satélites α y otros tipos de repeticiones de satélites, elementos transponibles y duplicaciones segmentarias5. La orientación de las repeticiones del centrómero, incluidas las repeticiones de orden superior de los satélites α, cambia dentro de un centrómero, formando repeticiones de ADN invertidas. A pesar del importante papel en la segregación cromosómica, el centrómero es un punto crítico para la rotura y reordenación cromosómica6,7,8,9,10. La recombinación entre secuencias repetitivas en el centrómero forma cromosomas anormales11,12,13. Las translocaciones robertsonianas, una fusión de dos cromosomas acrocéntricos en o alrededor de los centrómeros, son la forma de anomalía cromosómica observada con mayor frecuencia en humanos y afectan a 1 de cada 1000 recién nacidos14. Los isocromosomas cuyos brazos son imágenes especulares entre sí se encuentran comúnmente en las células cancerosas15. Los isocromosomas de chr21 y chrX causan los síndromes de Down y Turner, respectivamente16,17. En comparación con los centrómeros de mamíferos, los centrómeros de levadura de fisión S. pombe son cortos (35~110 kb) pero contienen repeticiones de ADN invertidas que flanquean una secuencia central no repetitiva18,19. En este hongo, los isocromosomas se producen utilizando repeticiones de ADN invertidas en el centrómero20,21,22. La menor complejidad de la secuencia de ADN del centrómero hace que la levadura de fisión sea un excelente sistema para estudiar el mecanismo de los GCR centroméricos.

Se requiere una recombinación homóloga para reparar daños perjudiciales en el ADN, como roturas de doble cadena23. Rad51 es el actor clave en la recombinación homóloga canónica y cataliza la búsqueda de homología y el intercambio de cadenas de ADN, formando bucles de desplazamiento. BRCA1 y BRCA2 de mamíferos facilitan la recombinación dependiente de Rad51, y sus mutaciones aumentan los GCR y predisponen a los portadores al cáncer24,25. La recombinación homóloga mantiene la integridad del centrómero. En los mamíferos, la inactivación de Rad51 aumenta la recombinación aberrante en los centrómeros9,10,26. En la levadura de fisión, la pérdida de Rad51 aumenta la formación de isocromosomas en los centrómeros20,21,27. El análisis detallado con levadura de fisión mostró que Rad51 promueve preferentemente una forma conservadora de recombinación: recombinación sin cruce en los centrómeros27,28, lo que suprime la formación de isocromosomas.

Otra recombinasa Rad52 promueve la recombinación/reparación de ADN dependiente de la homología independiente de Rad5129,30. Rad52, por sí solo, promueve la formación de bucles de desplazamiento, el recocido de cadena única (SSA) y el intercambio de cadena inversa utilizando cadenas de ARN. El Rad52 de levadura también facilita la carga de Rad51 en el ADN monocatenario recubierto con proteína A de replicación (RPA), mientras que el Rad52 humano no tiene la actividad de carga31. Tanto en los mamíferos como en la levadura de fisión, la recombinación no canónica dependiente de Rad52 provoca GCR en los centrómeros9,32. En la levadura de fisión, Rad52 provoca la formación de isocromosomas a través de la recombinación cruzada con Mus81, una endonucleasa específica de cruce27,32,33,34,35. La ubiquitinación de PCNA en lisina 107 y Msh2-Msh3 se ha implicado en la vía GCR dependiente de Rad5232,36. La abrazadera deslizante de ADN PCNA puede formar estructuras de ADN que conducen a GCR dependientes de Rad52 porque PCNA K107 es prescindible para la reparación de daños en el ADN36. La deleción de rad52 no elimina la formación de isocromosomas, lo que sugiere la presencia de una vía o vías GCR independientes de Rad52. Además, el evento inicial que conduce a los GCR sigue sin estar claro.

Para obtener información sobre el mecanismo de GCR, buscamos los factores que causan GCR en la cepa mutante rad51Δ y encontramos Srr1 y Skb1. En A. thaliana y ratones, el homólogo de Srr1 afecta la transcripción de los genes implicados en el ritmo circadiano37,38,39. Skb1 participa en una variedad de vías, incluida la morfología celular y la regulación del ciclo celular en la levadura de fisión40,41,42,43, y es el homólogo de la proteína humana arginina metiltransferasa 5 (PRMT5)44,45. Srr1 y Skb1 promueven específicamente la formación de isocromosomas. Sorprendentemente, la mutación srr1 aumenta la sensibilidad al daño en el ADN y la pérdida de cromosomas, pero no es esencial para la respuesta del punto de control al daño en el ADN, lo que sugiere que Srr1 promueve la reparación del daño en el ADN. Las mutaciones de srr1 y rad52 redujeron de forma aditiva las tasas de GCR, lo que sugiere que Srr1 y Rad52 tienen roles superpuestos y no superpuestos en los GCR. A diferencia de srr1, la eliminación de skb1 no aumenta la sensibilidad al daño del ADN y, curiosamente, reduce la pérdida de cromosomas en las células rad51Δ. La pérdida de Slf140,41 o Pom142,43, que funciona con Skb1 en la morfología celular y la regulación del ciclo celular, no redujo los GCR. Sin embargo, la mutación de residuos conservados en el dominio de arginina metiltransferasa (RMTasa) de Skb1 redujo fuertemente los GCR, lo que sugiere que Skb1 provoca la formación de isocromosomas a través de su actividad RMTasa. Estos hallazgos allanan nuevas vías para descifrar el mecanismo de los eventos de GCR en el centrómero.

Para obtener información sobre el mecanismo de los GCR, introdujimos mutaciones aleatorias en células rad51Δ que muestran tasas elevadas de GCR y buscamos los clones que muestran niveles reducidos de GCR. Para detectar GCR letales en células haploides, utilizamos un ChLC extracromosómico (~ 530 kb) derivado del cromosoma 3 de levadura de fisión (chr3) y detectamos GCR espontáneos que habían perdido los genes marcadores ura4+ y ade6+ (Fig. 1a)20,27 ,46. Para evaluar las tasas de GCR, los clones de levadura cultivados en medios mínimos de Edimburgo complementados con uracilo y adenina (EMM+UA) se replicaron en medios que contenían ácido 5-fluoroorótico (5-FOA+UA) que es tóxico para las células ura4+. De 24.000 clones, tres exhibieron reproduciblemente niveles reducidos de GCR. La secuenciación del genoma de uno de ellos identificó las mutaciones srr1/ber1-W157R y skb1-A377V en sus dominios SRR1-like y arginina metiltransferasa (RMTasa), respectivamente (fig. 1b). Los genes srr1 y skb1 están separados solo por 51 kb en chr2. El ensayo de réplica en placas muestra que, en comparación con la cepa rad51Δ parental, el clon rad51Δ que contiene las mutaciones srr1 y skb1 del número reducido de colonias en la placa 5-FOA+UA (Fig. 1c).

a Se muestra una ChLC extracromosómica utilizada para detectar GCR en este estudio. Se detectaron GCR que resultaron en Leu+ Ura– Ade– de Leu+ Ura+ Ade+. b Las proteínas Srr1/Ber1 y Skb1 contienen el dominio similar a SRR1 y el dominio arginina metiltransferasa (RMTasa), respectivamente. Alineadas están las secuencias de aminoácidos alrededor de las mutaciones srr1-W157R y skb1-A377V (círculos azules) en diferentes especies. Los residuos similares e idénticos entre las diferentes especies se destacan en gris pálido y gris oscuro, respectivamente. c La cepa original rad51∆ y el clon que además contenía las mutaciones srr1-W157R y skb1-A377V (TNF5411 y 5954) cultivadas en EMM+UA se replicaron en placas 5-FOA+UA. Las células Leu+ Ura– forman colonias selectivamente en placas 5-FOA+UA. d Tasas de GCR de las cepas de tipo salvaje, srr1∆, skb1∆, rad51∆, srr1∆ rad51∆, skb1∆ rad51∆ y srr1∆ skb1∆ rad51∆ (TNF5369, 5774, 5772, 5411, 5904 , 5788 y 8432 ). e Tasas de GCR de tipo salvaje, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆ (TNF8344), skb1∆ rad51∆, skb1-A377V rad51∆ (TNF8359) y srr1-W157R skb1-A377V rad51∆ (TNF8547 ). Cada punto representa un valor obtenido de un experimento independiente. Las líneas negras muestran la mediana. Las tasas relativas al tipo salvaje se muestran en la parte superior de cada grupo de puntos. La prueba de Mann-Whitney de dos colas entre las cepas de tipo salvaje y mutante y entre los pares indicados. ns, no significativo; ** p < 0,01; *** p < 0,001; ****, p < 0,0001. Los datos numéricos subyacentes a los gráficos d y e se proporcionan en la Tabla A en Datos complementarios 1.

Para establecer si se requiere Srr1 o Skb1 para los GCR, eliminamos los genes y determinamos las tasas de GCR mediante la prueba de fluctuación (Fig. 1d). En el fondo de tipo salvaje, srr1Δ pero no skb1Δ redujeron ligeramente las tasas de GCR, lo que demuestra que se requiere Srr1 para los GCR incluso en presencia de Rad51. Para nuestra sorpresa, no solo srr1Δ sino también skb1Δ redujeron las tasas de GCR en el fondo de rad51Δ, lo que demuestra que tanto Srr1 como Skb1 causan GCR. Sorprendentemente, la mutación doble de srr1Δ skb1Δ redujo aún más los GCR que las mutaciones simples, lo que sugiere que Srr1 y Skb1 tienen funciones que no se superponen en los GCR (ver más abajo). Para determinar si las mutaciones puntuales srr1-W157R y skb1-A377V reducen las tasas de GCR, introdujimos cada mutación en levadura por transformación (ver Métodos) y determinamos las tasas de GCR en el fondo rad51Δ (Fig. 1e). srr1-W157R redujo las tasas de GCR aunque menos prominente que srr1Δ, lo que sugiere una actividad residual de la proteína mutante Srr1. A diferencia de skb1Δ, skb1-A377V no redujo significativamente las tasas de GCR en células srr1+ rad51Δ. Sin embargo, skb1-A377V redujo las tasas de GCR en células srr1-W157R rad51Δ, lo que sugiere que skb1-A377V inactiva parcialmente la función Skb1. El efecto aditivo de srr1-W157R y skb1-A377V en las tasas de GCR puede explicar por qué nuestra selección genética identificó ambas mutaciones en el mismo clon. Estos resultados son consistentes con la idea de que Srr1 y Skb1 tienen roles que no se superponen en los GCR.

Las células de levadura en ciernes srr1/ber1Δ (resistentes a benomilo) son hiperrresistentes a los compuestos de bencimidazol que desestabilizan los microtúbulos: benomilo y nocodazol39. Sin embargo, las células srr1Δ de levadura de fisión no fueron más resistentes que las de tipo salvaje al tiabendazol (TBZ), el bencimidazol más popular utilizado en este hongo (Fig. 1 complementaria). En base a esto, decidimos llamar a este gen srr1 en lugar de ber1 para evitar confusiones.

Estudios previos mostraron que las células rad51Δ producen isocromosomas y relativamente pocos truncamientos cromosómicos27,32,36. Los isocromosomas se producen utilizando repeticiones de ADN invertidas en el centrómero, mientras que los truncamientos cromosómicos se forman mediante la adición de novo de secuencias de telómero a nuevos extremos cromosómicos (Fig. 2a). Los isocromosomas (300~400 kb) y los truncamientos (< 220 kb) se distinguen entre sí por su longitud. Para determinar qué GCR causan Srr1 y Skb1, los ADN cromosómicos de los clones de GCR parentales e independientes se prepararon en tapones de agarosa, se separaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y se tiñeron con bromuro de etidio (Fig. 2b). Los tamaños de los productos GCR se determinaron usando la ChLC parental (530 kb) y la escalera de ADN lambda (λ) como referencias. Las células rad51Δ produjeron muchos isocromosomas (300~400 kb) y una pequeña cantidad de truncamientos (< 220 kb), como se observó previamente20,27,32,36. La pérdida de Srr1 o Skb1 redujo la proporción de isocromosomas entre los productos de GCR. Las tasas totales de GCR se multiplicaron por la proporción de isocromosomas o truncamientos (Tabla 1) para obtener las tasas de isocromosomas y truncamientos, respectivamente (Fig. 2c). Tanto srr1Δ como skb1Δ eliminaron ~90 % de los isocromosomas formados en las células rad51Δ, pero ninguno redujo los truncamientos cromosómicos. Estos datos indican que Srr1 y Skb1 se requieren específicamente para la formación de isocromosomas en el centrómero.

a Se muestran las secuencias no repetitivas (cnt3) y repetitivas (imr3, dg, dh más internas y irc3 más externas) en cen3. El gen marcador ura4+ se coloca a 10 kb de cen3. La pérdida de Rad51 aumenta los isocromosomas y los truncamientos cromosómicos. b Los ADN cromosómicos preparados a partir de los clones GCR parentales (P) e independientes de las cepas rad51∆, srr1∆ rad51∆ y skb1∆ rad51∆ (TNF5411, 5904 y 5788) se separaron mediante PFGE. Los tamaños de las escaleras de ADN lambda (λ) se indican a la izquierda de los paneles. Los números de muestra de isocromosomas y truncamientos se muestran en azul y magenta, respectivamente. c Tasas de formación de isocromosomas y truncamiento cromosómico en cepas de tipo salvaje (TNF5369), rad51∆, srr1∆ rad51∆, skb1∆ rad51∆ y skb1-F319Y rad51∆ (TNF8391). Las tasas relativas a la tensión rad51∆ se indican en la parte superior de las barras. La prueba exacta de Fischer de dos colas entre el rad51∆ y otras cepas mutantes. ** p < 0,01; **** p < 0,0001. Los datos numéricos subyacentes a c se proporcionan en la Tabla B en Datos complementarios 1. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en la Fig. 5 complementaria.

Como Srr1 y Skb1 promueven la formación de isocromosomas mediada por repeticiones de centrómero, podrían estar involucrados en la reparación recombinante del daño en el ADN. Para probar esta posibilidad, realizamos un ensayo de dilución en serie y determinamos la sensibilidad de las cepas mutantes srr1 y skb1 a los agentes que dañan el ADN (Fig. 3a). El metanosulfonato de metilo (MMS) es un agente alquilante de ADN; la hidroxiurea (HU) agota la reserva de dNTP; La camptotecina (CPT) es un inhibidor de la topoisomerasa. Estos agentes interfieren con la progresión de las horquillas de replicación y crean rupturas en el ADN. En comparación con el tipo salvaje, las células srr1Δ exhibieron hipersensibilidad a todos los agentes que dañan el ADN (Fig. 3a, paneles superiores). En particular, las células srr1Δ rad51Δ fueron más sensibles que los mutantes individuales, lo que sugiere un papel para Srr1 en la respuesta al daño del ADN independiente de Rad51. La mutación srr1-W157R que redujo parcialmente las tasas de GCR (Fig. 1e) también aumentó parcialmente la sensibilidad al daño. Estos resultados sugieren que Srr1 facilita la respuesta al daño del ADN independiente de Rad51.

a Un ensayo de dilución en serie para determinar la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN. Los cultivos en fase logarítmica de tipo salvaje, srr1-W157R, srr1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ y srr1Δ rad51Δ (TNF3885, 8280, 5847, 5845, 8573 y 5849) preparados en medio YE3S se colocaron en YE3S placas complementadas con las concentraciones indicadas de MMS, HU o CPT (paneles superiores). Los cultivos en fase logarítmica de tipo salvaje, skb1Δ, rad51Δ y skb1Δ rad51Δ (TNF35, 8321, 8107 y 8320) preparados en medio YE se colocaron en placas YE (paneles inferiores). b Las células de tipo salvaje, srr1Δ, skb1Δ y chk1Δ (TNF35, 5943, 8321 y 3559) en la fase logarítmica en EMM se trataron con MMS al 0,01 %. Se indica el porcentaje de células que contienen un tabique. Se cuentan > 300 células en cada punto. La prueba de Chi-cuadrado de Pearson del índice de tabicación entre las cepas de tipo salvaje y otras en t = 8 h mostró que srr1Δ o skb1Δ no cambiaron significativamente el índice de tabicación (p > 0,05), pero chk1Δ lo aumentó. c Fosforilación de Chk1 en respuesta al tratamiento con MMS. Antes y después de 4 h de tratamiento con MMS al 0,01 %, se prepararon extractos a partir de células chk1+ (TNF7555) y chk1-HA+ de tipo salvaje, srr1Δ y skb1Δ (TNF8441, 8799 y 8802) y se separaron mediante SDS-PAGE al 8 %. Chk1-HA se detectó mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-HA (16B12). Las proteínas completas se tiñeron usando azul brillante de Coomassie. Los marcadores de tamaño (Takara, 3454 A, escala de proteína CLARAMENTE teñida) se muestran a la izquierda. wt, de tipo salvaje. Las imágenes sin recortar se muestran en la figura complementaria 6. d Las células de tipo salvaje y srr1Δ (TNF5369 y 5774) se sembraron en placas YE limitadas en adenina, en las que las células ade6– forman colonias rojas. e Tasas de pérdida de cromosomas de las cepas de tipo salvaje, srr1Δ, srr1-W157R, skb1Δ, rad51Δ, srr1-W157R rad51Δ y skb1Δ rad51Δ (TNF5369, 5774, 8308, 5772, 5411, 8344 y 578 8). La prueba de Mann-Whitney de dos colas. ** p < 0,01; *** p < 0,001. Los datos numéricos subyacentes a b, e se proporcionan en las Tablas C y D, respectivamente, en Datos complementarios 1.

La detención del ciclo celular causada por el punto de control del daño del ADN da tiempo a las células para reparar el ADN. Para determinar si se requiere Srr1 para detener la progresión del ciclo celular en respuesta al daño del ADN, determinamos el porcentaje de células septadas antes y después de la exposición a MMS (Fig. 3b). En el tipo salvaje, el índice de tabicación disminuyó de ~30 a 5 % después de la exposición a MMS, lo que demuestra la detención del ciclo celular inducida por MMS. El punto de control quinasa Chk1 es necesario para detener el ciclo celular47. En la cepa chk1Δ, el índice de tabicación no disminuyó al nivel de tipo salvaje. A diferencia de chk1Δ, en la cepa srr1Δ, el índice de tabicación disminuyó al nivel de tipo salvaje 6 h después de la adición de MMS, lo que sugiere que Srr1 es prescindible para detener el ciclo celular. Un retraso en la reducción de las células septadas puede deberse al lento crecimiento de la cepa srr1Δ. El tiempo de duplicación de las células de tipo salvaje y srr1Δ cultivadas en medios EMM a 30 °C fue de 2,48 ± 0,11 y 2,73 ± 0,10 h, respectivamente (p = 0,042, la prueba t de Student de dos colas) (Tabla E en Datos complementarios 1 ). Al igual que las células de tipo salvaje, las células srr1Δ se alargaron después de la exposición a MMS (Fig. 2a complementaria). Estos datos sugieren que Srr1 es prescindible para la detención del ciclo celular inducida por daños en el ADN. La quinasa Chk1 se fosforila y activa en respuesta al daño del ADN48,49. Para determinar si se requiere Srr1 para la fosforilación de Chk1, se expresó Chk1-HA marcado con HA a partir del locus cromosómico original, se separó por SDS-PAGE y se detectó usando anticuerpos anti-HA (Fig. 3c). Se observó una banda de Chk1-HA de migración lenta indicativa de la fosforilación48 tras el tratamiento con MMS en las cepas de tipo salvaje y srr1Δ, lo que demuestra que Srr1 no es esencial para la activación del punto de control de daños en el ADN.

La reparación del daño espontáneo del ADN es vital para mantener los cromosomas. Para determinar si se requiere Srr1 para mantener los cromosomas, determinamos las tasas de pérdida espontánea de ChLC mediante la prueba de fluctuación. Una colonia formada en placas YE3S se suspendió en agua esterilizada y las células se sembraron en placas YE limitadas en adenina, en las que las células que carecían de ade6+ formaron colonias rojas50 (Fig. 3d). Las colonias rojas se inspeccionaron adicionalmente en busca de auxotrofia de Leu y Ura para obtener la tasa de pérdida de cromosomas (es decir, Leu-Ura-Ade-) (Fig. 3e). Descubrimos que srr1Δ y srr1-W157R aumentaron la tasa de pérdida de cromosomas. rad51Δ también aumenta la pérdida de cromosomas, como se observó previamente32. En particular, srr1-W157R y rad51Δ aumentaron sinérgicamente la pérdida de cromosomas, lo que demuestra que Srr1 y Rad51 tienen funciones diferentes en el mantenimiento de los cromosomas.

En contraste con las mutaciones srr1, skb1Δ no aumentó la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN en presencia o ausencia de Rad51 (Fig. 3a, paneles inferiores), lo que demuestra que Skb1 es prescindible para reparar el daño en el ADN inducido por MMS, HU, o CPT. Skb1 también era prescindible para la detención del ciclo celular y la fosforilación de Chk1 inducida por el tratamiento con MMS (Fig. 3b, c). Curiosamente, sin embargo, skb1Δ redujo fuertemente la pérdida de cromosomas en las células rad51Δ (Fig. 3e), lo que demuestra que Skb1 provoca la formación de isocromosomas y la pérdida de cromosomas en las células rad51Δ.

Rad52 promueve la formación de isocromosomas en células rad51Δ. La mutación rad52-R45K en el dominio de unión al ADN N-terminal afecta específicamente la actividad de hibridación monocatenaria (SSA) in vitro y reduce la formación de isocromosomas en la misma medida que rad52Δ32, lo que sugiere un papel de SSA mediado por Rad52 en la formación de isocromosomas. Las mutaciones rad52-R45K, rad52Δ y srr1Δ eliminan ~90 % de los isocromosomas en las células rad51Δ (Fig. 2c y ref. 32), lo que indica que tanto Rad52 como Srr1 son esenciales para la vía principal de formación de isocromosomas. Para definir la relación entre Srr1 y Rad52, creamos los mutantes dobles srr1 rad52 y determinamos las tasas de GCR (Fig. 4a). En particular, srr1Δ y rad52-R45K redujeron de forma aditiva las tasas de GCR en el fondo de tipo salvaje, lo que sugiere que Srr1 y Rad52 también tienen roles que no se superponen en los GCR. De acuerdo con esta idea, srr1-W157R y rad52-R45K redujeron de forma aditiva las tasas de GCR en el fondo de rad51Δ. La ubiquitinación de PCNA (codificado por el gen pcn1) en la lisina 107 (K107) juega un papel en los GCR36 dependientes de Rad52. Como se esperaba, srr1-W157R y pcn1-K107R también redujeron de forma adicional las tasas de GCR en células rad51Δ (Fig. 4a). Estos datos muestran que Srr1 y Rad52 tienen funciones superpuestas y no superpuestas en los GCR.

a Tasas de GCR de tipo salvaje, srr1∆, rad52-R45K, srr1∆ rad52-R45K, rad51∆, srr1-W157R rad51∆, rad52-R45K rad51∆, srr1-W157R rad52-R45K rad51∆, pcn1- K107R rad51∆ , y srr1-W157R pcn1-K107R rad51∆ (TNF5369, 5774, 6599, 8281, 5411, 8344, 7122, 8663, 6761 y 8601). La prueba de Mann-Whitney de dos colas. b Análisis de tétrada de srr1∆ y rad52∆. Se cruzaron los haploides srr1::kanR y rad52::hygR (TNF5943 y 7988), y las tétradas resultantes se diseccionaron en placas YE bajo un microscopio. Se muestran imágenes de tres conjuntos de tétradas viables de tres esporas en las que las progenies srr1::kanR rad52::hygR no formaron colonias. c El agotamiento de Rad52 por el sistema AID afecta el crecimiento de las células srr1∆. rad52-AID, srr1∆ rad52-AID, OsTIRF74A, srr1∆ OsTIRF74A, rad52-AID OsTIRF74A y srr1∆ rad52-AID OsTIRF74A (TNF8614, 8621, 8616, 8623, 8617 y 8627) fueron visto en placas YE complementado con 200 nM 5'a-IAA que induce el agotamiento de Rad52. Se observaron focos de Rpa2-mCherry (punta de flecha) mediante microscopía de fluorescencia en células de tipo salvaje (TNF5492). Las imágenes de fluorescencia y DIC están superpuestas. DIC, contraste de interferencia diferencial. Una barra que se muestra debajo de la imagen indica 10 µm. El gráfico de barras muestra los porcentajes de núcleos que contienen al menos un foco Rpa2-mCherry en cepas de tipo salvaje y srr1∆ (TNF8803). Las barras representan la media de tres experimentos independientes. La prueba t de Student de dos colas. Se observaron focos de Rad52-GFP (punta de flecha) en células de tipo salvaje (TNF4442). El gráfico de barras muestra los porcentajes de núcleos que contienen al menos un foco Rad52-GFP en cepas de tipo salvaje y srr1∆ (TNF6130). Los datos numéricos que subyacen a a se proporcionan en la Tabla A, y los que subyacen a d y e están en la Tabla F en Datos complementarios 1.

Cruzamos las cepas haploides srr1Δ y rad52Δ y diseccionamos las tétradas pero no logramos obtener progenies srr1Δ rad52Δ (Fig. 4b), lo que sugiere defectos de crecimiento sintético de la doble deleción srr1 rad52. Para confirmar esto, agotamos Rad52 en células srr1Δ usando el sistema degron 2 inducido por auxina (AID2)51. En presencia de la proteína F-box OsTIR1F74A, un análogo de auxina 5'-adamantyl-IAA (5'a-IAA) induce la degradación dependiente de poliubiquitina de la proteína Rad52 etiquetada con AID, Rad52-AID. La adición de 5'a-IAA al medio perjudicó significativamente el crecimiento celular de la cepa srr1Δ rad52-AID en comparación con la cepa rad52-AID (Fig. 4c, últimas dos filas). Estos resultados muestran roles no superpuestos para Srr1 y Rad52 en el crecimiento celular. Dada la hipersensibilidad de las células srr1Δ a los agentes que dañan el ADN (Fig. 3a), Srr1 puede promover la reparación del daño espontáneo del ADN. El ADN monocatenario se forma durante la replicación, la transcripción y la reparación/recombinación del daño del ADN. El complejo de la proteína de replicación A (RPA) se une al ADN monocatenario con gran afinidad52. Detectamos la formación espontánea del foco de Rpa2-mCherry expresado a partir del locus32 cromosómico original y descubrimos que srr1Δ aumentó la fracción de células que contenían el foco Rpa2-mCherry (Fig. 4d), lo que sugiere la acumulación de ADN monocatenario en células srr1Δ. Rad52 forma focos nucleares en sitios de daño espontáneo en el ADN27,53. srr1Δ también aumentó las células que contienen el foco Rad52-GFP (Fig. 4e), lo que muestra que Srr1 suprime la formación del foco Rad52.

Srr1 tiene un dominio conservado evolutivamente llamado dominio similar a SRR1 (Fig. 5a). La estructura de la proteína Srr1 predicha por los métodos AlphaFold54,55 consiste en el dominio similar a SRR1 que contiene láminas β intercaladas por hélices α con extensiones intrínsecamente desordenadas56 en los extremos N y C (Fig. 5b, c). El sitio de mutación srr1-W157R está presente en el dominio similar a SRR1. Para extender esto, cambiamos los residuos conservados en el dominio similar a SRR1 a alanina: srr1-D111A, P112A y srr1-H148A (Fig. 5a, b). Ambas mutaciones srr1-D111A, P112A y srr1-H148A redujeron las tasas de GCR (Fig. 5d). srr1-D111A, P112A y srr1-H148A también aumentaron la sensibilidad al daño del ADN (Fig. 5e). Estos resultados demuestran que el dominio similar a SRR1 desempeña un papel esencial en los GCR y la reparación de daños en el ADN. Como se esperaba del tiempo de duplicación prolongado (Tabla E en Datos complementarios 1), las células srr1Δ formaron pequeñas colonias en el medio de la placa en comparación con las células de tipo salvaje (Figura complementaria 2b). Al igual que las células srr1Δ, las células srr1-W157R, srr1-D111A, P112A y srr1-H184A produjeron pequeñas colonias (Fig. 2b complementaria), consistentes con el papel del dominio similar a SRR1 incluso en ausencia de daño en el ADN exógeno.

a Las posiciones de los sitios de mutación srr1-D111A,P112A, -H148A y -W157R de la levadura de fisión se indican mediante círculos azules. Los residuos similares e idénticos entre las diferentes especies se destacan en gris pálido y gris oscuro, respectivamente. b Un modelo de cinta de la estructura Srr1 predicha por los métodos AlphaFold. Se indican las posiciones de los sitios de mutación. c Un modelo de superficie de la estructura Srr1. Los residuos con carga positiva y negativa se muestran en azul y rojo, respectivamente. d Tasas de GCR de tipo salvaje, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆, srr1-D111A,P112A rad51∆ y srr1-H148A rad51∆ (TNF5369, 5411, 5904, 8344 , 8686 y 8387) . La prueba de Mann-Whitney de dos colas. Los datos numéricos se proporcionan en la Tabla A en Datos complementarios 1. e La mutación de los residuos conservados en el dominio similar a SRR1 aumenta la sensibilidad a MMS, HU y CPT. Las células de tipo salvaje, srr1∆, srr1-W157R, srr1-H148A y srr1-D111A,P112A (TNF3885, 5847, 8280, 8275 y 8274) se colocaron en YE3S complementadas con las concentraciones indicadas de MMS, HU o CPT .

Skb1 se ha implicado en una amplia gama de vías, incluida la morfología celular y la regulación del ciclo celular. Skb1 interactúa con Slf1 y se localiza en los nódulos corticales de las células dependiendo de Slf1, promoviendo la morfología celular similar a un bastón de la levadura de fisión40,41. La quinasa Pom1 de la familia DYRK regula negativamente la progresión del ciclo celular para garantizar que las células crezcan hasta cierto tamaño antes de entrar en mitosis42. La evidencia genética muestra que Skb1 actúa en la vía Pom1 para regular el ciclo celular independientemente de su actividad metiltransferasa43. Para preguntar si Skb1 promueve la formación de isocromosomas a través de estas vías, interrumpimos los genes slf1 o pom1 y determinamos las tasas de GCR de las cepas mutantes (Fig. 6a). A diferencia de skb1Δ, slf1Δ y pom1Δ aumentaron ligeramente las tasas de GCR en el fondo de tipo salvaje y tampoco redujeron las tasas de GCR en el fondo rad51Δ, lo que demuestra que Skb1 promueve la formación de isocromosomas a través de la función independiente de Slf1 o Pom1.

a Índices de GCR de las cepas de tipo salvaje, skb1∆, slf1∆, pom1∆, rad51∆, skb1∆ rad51∆, slf1∆ rad51∆ y pom1∆ rad51∆ (TNF5369, 5772, 8811, 8813, 5411, 5788, 8834 , y 8838). b Se muestra la estructura del dominio de arginina metiltransferasa de la levadura de fisión S. pombe Skb1 predicha por métodos AlphaFold y la estructura cristalina del dominio de arginina metiltransferasa de C. elegans PRMT5 (código PDB 3UA3) con SAH, un análogo de SAM. Se indican las posiciones de los residuos de fenilalanina (F) y ácido glutámico (E) esenciales para la actividad de la arginina metiltransferasa. c Tasas de GCR de las cepas de tipo salvaje, rad51∆, skb1∆ rad51∆, skb1-A377V rad51∆, skb1-F319Y rad51∆ y skb1-E422A,E431A rad51∆ (TNF5369, 5411, 5788, 8359, 8 391 y 8474 ). d PFGE separó los productos GCR de la cepa skb1-F319Y rad51∆. Los números de muestra de isocromosomas y truncamientos se muestran en azul y magenta, respectivamente. e Tasas de GCR de las cepas de tipo salvaje, skb1∆, rad52-R45K, skb1∆ rad52-R45K, rad51∆, skb1∆ rad51∆, rad52-R45K rad51∆ y skb1∆ rad52-R45K rad51∆ (TNF5369, 577 2, 6599 , 8324, 5411, 5788, 7122 y 8345). La prueba de Mann-Whitney de dos colas. Los datos numéricos subyacentes a, c y e se proporcionan en la Tabla A en Datos complementarios 1. Las imágenes de gel sin recortar se muestran en la Fig. 5 complementaria.

Skb1 es el homólogo de PRMT5 arginina metiltransferasa (RMTasa)44,45. La estructura del dominio RMTasa de S. pombe Skb1 predicha por los métodos AlphaFold54,55 es muy similar a la estructura cristalina del dominio RMTasa PRMT5 de C. elegans (Fig. 6b) y a las estructuras predichas de H. sapiens, A. thaliana y S homólogos de Skb1/PRMT5 de .cerevisiae (Fig. 3 complementaria). La mutación skb1-A377V que aislamos está presente en el dominio RMTase (Figs. 1b, 6b), pero el fenotipo mutante no fue tan prominente como skb1Δ (Fig. 6c). Para determinar si la actividad de RMTasa es esencial para que Skb1 promueva la formación de isocromosomas, mutamos los residuos de Skb1 F319, E422 y E431 equivalentes a los importantes para la actividad de RMTasa in vitro de C. elegans PRMT557. Encontramos que las mutaciones skb1-F319Y y skb1-E422A, E431A redujeron fuertemente las tasas de GCR en células rad51Δ (Fig. 6c). Es importante destacar que la misma mutación skb1-E422A,E431A no interfiere con su función en la regulación del ciclo celular43. El análisis de PFGE mostró que, al igual que skb1Δ, skb1-F319Y redujo los isocromosomas pero no los truncamientos cromosómicos en las células rad51Δ (Figs. 2c, 6d y Tabla 1). También examinamos la relación entre Skb1 y Rad52 y encontramos que skb1Δ no redujo significativamente las tasas de GCR en células rad52-R45K o rad52-R45K rad51Δ (Fig. 6e). Juntos, estos datos indican que Skb1 promueve la formación de isocromosomas dependientes de Rad52 a través de su actividad RMTasa.

Los GCR ocurren usando secuencias repetitivas presentes en el genoma eucariota. Sin embargo, el mecanismo de los GCR mediados por repetición se desconoce en gran medida. Aquí, encontramos que Srr1 y Skb1 conservados evolutivamente promueven la formación de isocromosomas utilizando repeticiones de ADN invertidas en el centrómero. Sorprendentemente, srr1 aumentó la sensibilidad al daño del ADN en las células rad51Δ pero no eliminó la respuesta del punto de control, lo que sugiere que Srr1 promueve la reparación del ADN independiente de Rad51 propensa a los GCR. Las mutaciones srr1 y rad52 de forma aditiva, mientras que skb1 y rad52 redujeron epistáticamente las tasas de GCR. A diferencia de las mutaciones de srr1, skb1Δ no aumentó la sensibilidad al daño del ADN y redujo la pérdida de cromosomas en las células rad51Δ. A través de la actividad RMTase, Skb1 podría formar estructuras de ADN que conduzcan a GCR dependientes de Rad52.

Srr1 y Skb1 promueven la formación de isocromosomas en el centrómero. Encontramos las mutaciones srr1-W157R y skb1-A377V en el mismo clon que exhibe niveles reducidos de GCR (Fig. 1c). La eliminación de srr1 o skb1 redujo las tasas de GCR en las células rad51Δ (Fig. 1d), lo que indica que tanto Srr1 como Skb1 promueven los GCR. Srr1 parece más integral para los GCR que Skb1 porque srr1Δ pero no skb1Δ redujeron las tasas de GCR incluso en presencia de Rad51 (Fig. 1d). El análisis físico de los productos de GCR mostró que Srr1 y Skb1 son responsables de ~ 90% de los isocromosomas producidos en las células rad51Δ pero prescindibles de los truncamientos cromosómicos (Fig. 2c). Dado el hecho de que los puntos de ruptura de los isocromosomas están presentes en la repetición del centrómero20, estos resultados indican que Srr1 y Skb1 promueven GCR mediados por repetición en el centrómero. Queda por dilucidar si Srr1 o Skb1 causan GCR fuera del centrómero. Las mutaciones srr1 y skb1 redujeron de manera adicional las tasas de GCR en las células rad51Δ (Fig. 1d, e), lo que sugiere que Srr1 y Skb1 tienen funciones que no se superponen en las GCR (ver más abajo).

¿Cómo promueve Srr1 la formación de isocromosomas? Proponemos que Srr1 promueva la reparación del daño del ADN propenso a los GCR. En el tipo salvaje, Rad51 repara principalmente el daño perjudicial del ADN, como las roturas de doble cadena del ADN, y protege la integridad de los cromosomas. Sin embargo, en ausencia de Rad51, el daño del ADN que no se repara se canalizará hacia otras vías de reparación, como la vía de recombinación dependiente de Rad5229,30. Srr1 está involucrado en la respuesta al daño del ADN independiente de Rad51, ya que las mutaciones srr1 y rad51 aumentaron de manera adicional la sensibilidad a MMS, HU o CPT (Figs. 3a, 5e). Srr1 no fue esencial para la detención del ciclo celular inducida por MMS y la fosforilación de Chk1 (Fig. 3b, c), lo que sugiere que Srr1 promueve la reparación del daño en el ADN en lugar de la respuesta del punto de control. Esto es consistente con el hecho de que las quinasas de punto de control Chk1 y Rad3 suprimen pero no promueven los GCR20,58. Al igual que rad52Δ y rad52-R45K32, srr1Δ eliminó ~90 % de los isocromosomas en las células rad51Δ (Fig. 2c), lo que demuestra que Srr1 y Rad52 son esenciales para la vía principal de formación de isocromosomas. Sin embargo, Srr1 y Rad52 también pueden tener funciones no superpuestas en los GCR, ya que las mutaciones de srr1 y rad52 redujeron de manera adicional las tasas de GCR (Fig. 4a). Esto está respaldado por el efecto aditivo de srr1 y skb1 (Fig. 1d, e) y el efecto epistático de skb1 y rad52 en las tasas de GCR (Fig. 6e). srr1Δ causó defectos de crecimiento sintético con rad52Δ y focos espontáneos acumulados de Rpa2 y Rad52 (Fig. 4b-e). srr1Δ aumentó el tiempo de duplicación y produjo colonias pequeñas en comparación con el tipo salvaje (Tabla E en Datos complementarios 1; Figura complementaria 2b). Srr1 puede promover la reparación del daño espontáneo del ADN. La hipersensibilidad de las células srr1 a los agentes que dañan el ADN respalda esto, pero no excluimos la posibilidad de que Srr1 suprima la formación de daño espontáneo en el ADN. Aunque su función bioquímica sigue siendo desconocida, encontramos que el dominio similar a SRR1 es crítico para los GCR y la reparación de daños en el ADN. Las mutaciones srr1-D111A, P112A y srr1-H148A que alteran los residuos conservados evolutivamente en el dominio similar a SRR1 redujeron fuertemente las tasas de GCR y aumentaron la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN, que interfieren con la progresión de la horquilla y eventualmente crean roturas de ADN (Fig. 5 ). La extensión N-terminal de Srr1 se predice intrínsecamente desordenada en la ref. 56 y contiene residuos cargados positivamente en la levadura de fisión y otros organismos, incluidos los humanos, lo que sugiere su papel en la interacción con otras moléculas. Curiosamente, la comparación de la estructura de la proteína con Dali server59 sugiere que el dominio similar a SRR1 tiene una similitud estructural con un conjunto de proteínas, incluidas las metiltransferasas (Datos complementarios 2). La inactivación del SRRD homólogo de Srr1 en células de ratón altera la replicación del ADN37, lo que sugiere que el Srr1 de los mamíferos también desempeña un papel en la reparación del daño espontáneo del ADN creado durante la replicación del ADN. En plantas y mamíferos, SRR1/SRRD afecta la transcripción de los genes implicados en el ritmo circadiano37,38,60, lo que plantea la posibilidad de que Srr1 promueva la respuesta al daño del ADN y los GCR a través de la regulación transcripcional. Curiosamente, la mutación srr1/ber1 en la levadura en ciernes causa defectos de crecimiento sintético con mutaciones en las proteínas del centrómero, incluida la variante Cse4/CENP-A39 de la histona H3 específica del centrómero. Aunque, a diferencia de las células srr1Δ/ber1Δ de levadura en ciernes, las células srr1Δ de levadura de fisión no eran hiperrresistentes a un fármaco desestabilizador de microtúbulos, aún es posible que Srr1 promueva la formación de isocromosomas al afectar la estructura del centrómero. Srr1 se ha localizado tanto en el núcleo como en el citosol en la levadura de fisión61, pero aún se desconoce si Srr1 se localiza en el centrómero. Se requieren trabajos futuros para abordar cómo Srr1 promueve la formación de isocromosomas y la respuesta al daño del ADN.

Se ha demostrado que una mutación en la helicasa Fbh1 suprime los defectos de crecimiento y recombinación de las células rad52Δ62, lo que plantea la posibilidad de que se hayan introducido mutaciones espontáneas de fbh1 en nuestra cepa rad52Δ y afecten a los GCR. Sin embargo, anteriormente no mostramos mutaciones de fbh1 en nuestra cepa36 rad52Δ rad51Δ utilizada para determinar las tasas de GCR. Tampoco confirmamos mutaciones de fbh1 en todas las cepas mutantes rad52 y la cepa srr1Δ rad51Δ utilizada en este estudio (Datos complementarios 3). Además, la eliminación de fbh1 no afectó significativamente la formación de isocromosomas en células rad51Δ (Fig. 4 complementaria).

Skb1 se ha implicado en muchas vías. Sin embargo, nuestros datos muestran que Skb1 promueve la formación de isocromosomas independientemente de su papel en la morfología celular y la regulación del ciclo celular mediada por Slf1 y Pom1, respectivamente (Fig. 6a). Skb1 y Slf1 se unen entre sí y se requieren mutuamente para su localización en los nodos corticales celulares40. La localización del nódulo cortical no es esencial para que Skb1 promueva la formación de isocromosomas, ya que slf1Δ no redujo las tasas de GCR. En las células rad51Δ, rad52-R45K reduce la formación de isocromosomas y aumenta la sensibilidad al daño del ADN32. La mutación pcn1-K107R en una abrazadera deslizante de ADN PCNA y rad52-R45K reducen epistáticamente la formación de isocromosomas, pero pcn1-K107R no aumenta la sensibilidad al daño del ADN36. Al igual que pcn1-K107R, skb1Δ afecta la formación de isocromosomas dependientes de Rad52 (Fig. 6e) pero no aumenta la sensibilidad al daño del ADN (Fig. 3a). Junto con PCNA, Skb1 podría formar estructuras de ADN que conduzcan a GCR dependientes de Rad52. Las células rad51Δ mostraron niveles elevados de pérdida de cromosomas y GCR, probablemente debido a la incapacidad para reparar el daño espontáneo del ADN. Como en el caso de los GCR (Fig. 1d), skb1Δ reduce la pérdida de cromosomas en rad51Δ pero no en las células de tipo salvaje (Fig. 3e), lo que muestra que Skb1 causa GCR y pérdida de cromosomas en las células rad51Δ. Skb1 es el homólogo de levadura de fisión de PRMT5 arginina metiltransferasa (RMTasa)44,63. PRMT5 se sobreexpresa en muchos tumores malignos, incluido el cáncer de mama, y ​​desempeña un papel en el desarrollo del cáncer64. Curiosamente, las proteínas que afectan la estructura y la replicación de la cromatina, como las histonas, la endonucleasa de colgajo de ADN Fen1 y p53, se han encontrado como sustratos de PRMT565,66,67,68. Skb1 también interactúa con Shk1, una quinasa activada por p21 (PAK) que regula negativamente la progresión del ciclo celular69. La mutación de los residuos esenciales para la actividad RMTase:57 skb1-F319Y y skb1-E422A,E431A redujo fuertemente las tasas de GCR, lo que sugiere que Skb1 promueve los GCR a través de la actividad RMTase. Es crucial identificar los sustratos clave de Skb1 RMTase que inducen inestabilidad cromosómica en el futuro. No obstante, nuestros hallazgos allanaron una nueva vía para dilucidar el mecanismo de los GCR en el centrómero.

Las cepas de levadura de fisión utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 1 y están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los cebadores de ADN utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 2. Las células se cultivaron en medio de extracto de levadura (YE) o medio mínimo de Edimburgo 2 (EMM) 70 a 30 ° C, a menos que se indique lo contrario. Se agregaron aminoácidos o bases a una concentración final de 225 mg L−1. El medio de base de nitrógeno de levadura (YNB) contenía 7 g L-1 de base de nitrógeno de levadura (BD Difco, BD 291940) y 20 g L-1 de glucosa. El medio YNB se complementa con 1 g L−1 de ácido 5-fluoroorótico (Apollo Scientific, PC4054) y 56 mg L−1 de uracilo (Nacalai Tesque, 35824–82) para preparar el medio 5-FOA. Los medios sólidos contenían 1,5 % de agarosa (Nacalai Tesque, 01028–85). La transformación de la levadura se realizó por el método de acetato de litio/PEG71. Las células de levadura se cultivaron en medio YE o YE3S hasta la fase logarítmica (1–2 × 107 células mL−1) y se recolectaron por centrifugación. Las células se lavaron una vez con agua esterilizada y dos veces con 1 ml de tampón LiAc/TE (acetato de litio 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM). Las células se suspendieron en tampón LiAc/TE a > 2 × 109 células mL−1. Se mezclaron 100 μL de la suspensión celular con 5 μL de ADN de esperma de salmón (10 mg mL−1) y el ADN de introducción y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Después de agregar 260 μL de PEG/LiAc/TE (40 % PEG4000, acetato de litio 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM), el tubo se incubó durante 30 min con rotación. Después de agregar 43 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), el tubo se incubó a 42 °C durante 5 min. Las células se recolectaron por centrifugación a 503 × g durante 30 s, se suspendieron en medios YE o YE3S y se sembraron en medios no selectivos. Después de un día de incubación, las células se replicaron en placas en un medio suplementado con G418 (Nacalai Tesque, 09380–86) o higromicina B (Nacalai Tesque, 09287–87) a una concentración final de 100 µg mL−1 o clonNAT (Werner BioAgents, 5.001.000) a 50 µg mL−1 para seleccionar los transformantes. No recogimos colonias excepcionalmente grandes de mutantes rad52 porque pueden contener una mutación fbh162.

Para buscar los genes que causan GCR en células rad51Δ, introdujimos mutaciones aleatorias en la levadura esencialmente, como se describió anteriormente en la ref. 32. El ácido nitroso se usó como mutágeno porque introduce mutaciones de manera eficiente en células deficientes en la reparación del ADN, como en las células de tipo salvaje72. Las células rad51Δ que contenían ChLC (TNF5411) cultivadas en EMM se recolectaron en la fase logarítmica (5 × 106 células mL−1), se suspendieron en agua y se mantuvieron durante la noche a 4 °C. Después de la centrifugación, las células se suspendieron en 0,8 ml de solución de ácido nitroso 0,01 M preparada antes de su uso disolviendo nitrato de sodio (Wako, 195-20562) en acetato de sodio 0,5 M (pH 4,8) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. Después de añadir un volumen igual del tampón de parada (3,6 % Na2HPO4 · 12H2O y 1 % de extracto de levadura) a la suspensión celular, las células se sembraron en placas EMM+UA. La eficiencia de siembra de las células mutagenizadas determinada usando placas EMM fue de alrededor del 10%. Se incubaron 24 000 clones independientes como parches en placas EMM+UA durante 2–3 días a 30 °C y luego se transfirieron a placas 5-FOA+UA para determinar semicuantitativamente la tasa de auxótrofo de uracilo, resultante de GCR o una mutación puntual en el gen ura4. 80 clones produjeron un número reducido de colonias en placas de 5-FOA+UA. El análisis PFGE mostró que seis contenían los tamaños aberrantes de la ChLC parental. Los 74 clones restantes se cruzaron con células de tipo salvaje que contenían ChLC. Tres clones exhibieron tasas de GCR reducidas de manera reproducible. La secuenciación profunda del ADN genómico se llevó a cabo utilizando MiSeq (Illumina, San Diego, CA) y las mutaciones se identificaron mediante un análisis de enlace agrupado73,74. Los datos de la secuencia de nucleótidos de la cepa parental y un conjunto de nueve segregantes mutantes obtenidos mediante el retrocruzamiento de uno de los tres clones están disponibles en el archivo de lectura secuenciada de DDBJ con los números de acceso DRX042095 y DRX042098, respectivamente.

La cepa srr1::kanMX6 se creó mediante dos rondas de reacción en cadena de la polimerasa, PCR75. Los cebadores srr1-kan3 y srr1-kan5 se diseñaron de manera que el lado 3' fuera complementario a srr1 y el lado 5' fuera complementario al gen kanMX6 en el plásmido pFA6a-kanMX676. En la primera ronda de PCR, se amplificaron las regiones flanqueantes de srr1 de 0,5 kb, utilizando pares de cebadores srr1-kan3/srr1-3 o srr1-kan5/srr1-1 y ADN genómico de levadura de fisión como plantilla. La segunda ronda de PCR se llevó a cabo en presencia de los dos fragmentos de PCR, los cebadores pFA6a-kanMX6 y srr1-1/srr1-3, para producir el fragmento de ADN que contenía la construcción srr1::kanMX6. El fragmento de PCR de 2,5 kb se introdujo en la levadura.

La cepa skb1::kanMX6 (o skb1::hphMX6) se creó de forma similar a la descrita anteriormente. En la primera ronda de PCR, se amplificaron las regiones flanqueantes de skb1 de 0,5 kb cada una, utilizando pares de cebadores skb1-1/skb1-kan5 o skb1-kan3/skb1-2. La segunda ronda de PCR se llevó a cabo en presencia de los dos fragmentos de PCR, pFA6a-kanMX6 (o pFA6a-hphMX6) y cebadores skb1-1/skb1-2, para producir el fragmento de ADN que contenía el skb1::kanMX6 o skb1 ::construcción hphMX6. El fragmento de PCR de 2,5 o 2,7 kb se introdujo en la levadura.

Para crear la cepa mutante srr1-W157R, el gen ura4+ se introdujo en el gen srr1 en células ura4-D18, lo que produjo células ura4+:srr1. En la primera ronda de PCR, se amplificaron regiones de 0,5 kb utilizando pares de cebadores srr1-F1/srr1-ura4AN5 y srr1-ura4AN3/srr1-R1. La segunda ronda de PCR se llevó a cabo en presencia de los dos fragmentos de PCR, un plásmido que contenía el fragmento genómico ura4+ y los cebadores srr1-F1/srr1-R1. El fragmento de PCR de 3 kb se transformó en células de levadura y los transformantes ura4+ se seleccionaron en medio EMM. A continuación, la región genómica que contenía la mutación srr1-W157R se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores srr1-1/srr1-R1 y el ADN molde se preparó a partir del mutante srr1-W157R skb1-A377V aislado en el cribado. El producto de PCR de 1,5 kb se introdujo en la cepa ura4+:srr1 y los transformantes ura4– se seleccionaron en placas de 5-FOA. La secuenciación de ADN confirmó la integración de la mutación srr1-W157R y ninguna mutación adicional. Después de la construcción de la cepa ura4+:skb1, se creó la cepa skb1-A377V de la misma manera, excepto que se usaron cebadores skb1-F1/skb1-2.

El fragmento mutante srr1-H148A también se creó en dos rondas de PCR. En primer lugar, se amplificaron fragmentos de 0,6 y 0,5 kb utilizando pares de cebadores srr1-H148A-F/srr1-R1 y srr1-H148A-R/srr1-F1, respectivamente, y ADN genómico de levadura de fisión como plantilla. Tanto los cebadores srr1-H148A-F como srr1-H148A-R contienen la mutación srr1-H148A. Los dos fragmentos de PCR superpuestos se unieron en la segunda ronda de PCR en presencia de los cebadores srr1-F1/srr1-R1. El producto de 1,1 kb se introdujo en la cepa ura4+:srr1 y los transformantes ura4– se seleccionaron en placas de 5-FOA. El mutante srr1-D111A,P112A se creó de manera similar. En la primera ronda de PCR, se amplificaron fragmentos de 0,7 y 0,5 kb utilizando pares de cebadores srr1-DPAA-F/srr1-R1 y srr1-DPAA-R/srr1-F1, respectivamente. Los dos fragmentos de PCR se unieron en la segunda reacción de PCR que contenía los cebadores srr1-F1/srr1-R1. El producto de 1,1 kb se introdujo en la cepa ura4+:srr1. Los mutantes skb1-F319Y y skb1-E422A,E431A se generaron de la misma manera usando los pares de cebadores skb1-F1/skb1-F319Y-R y skb1-F319Y-F/skb1-R1, y skb1-F1/skb1-doubleE-R y pares de cebadores skb1-doubleE-F/skb1-R1, respectivamente. Integración correcta de las mutaciones puntuales, pero la secuenciación de Sanger no confirmó mutaciones adicionales.

Las tasas de GCR se determinaron mediante la prueba de fluctuación como se describió anteriormente en la ref. 36. Las células de levadura se incubaron en placas EMM+UA durante 6 a 8 días. Se utilizaron colonias individuales para inocular 10 ml de medio líquido EMM+UA. Después de 1 a 2 días de incubación, las células se sembraron en placas de 5-FOA+UA y YNB+UA. Después de 5 a 9 días de incubación, se contaron las colonias formadas en 5-FOA+UA y YNB+UA para determinar el número de células Leu+ Ura– y Leu+, respectivamente. Aproximadamente seis colonias de cada placa 5-FOA+UA se sembraron en EMM+UA para examinar el tamaño de la colonia y luego se transfirieron a placas EMM+U para inspeccionar la auxotrofia de adenina. El número de células Leu+ Ura– Ade–, indicativo de GCR, se obtuvo restando el número de células Leu+ Ura– Ade+ del número de células Leu+ Ura–. Las tasas de GCR por división celular se determinaron como se describe en la ref. 77. Cuando comenzamos con los cultivos de levadura, elegimos colonias al azar de diferentes tamaños. Recuperamos colonias tanto grandes como pequeñas en placas de 5-FOA+UA para análisis de PFGE, según la proporción de su aparición.

Las tasas de pérdida de cromosomas se determinaron mediante la prueba de fluctuación como se describió anteriormente en la ref. 27. Una sola colonia formada en placas YE3S después de 3 o 4 días de incubación se suspendió en agua esterilizada y las células se sembraron en placas YE. Después de 4 a 6 días de incubación, se contaron las colonias blancas y rojas. Las colonias rojas, indicativas de pérdida de ade6, se transfirieron a placas YE3S y EMM+UA para inspeccionar la auxotrofia de leucina. Las colonias cultivadas en placas YE3S se replicaron en placas EMM+UL y EMM+AL para probar la auxotrofia de adenina y uracilo, respectivamente. El número de células Leu-Ura-Ade-, indicativas de pérdida cromosómica ChLC, y el número total de células formadoras de colonias se utilizaron para obtener la tasa de pérdida cromosómica por división celular77.

Cada clon de GCR se obtuvo de un cultivo independiente para evitar múltiples clones del mismo padre. Las células se cultivaron en medio YE3S a 25 °C durante 12 a 24 h. Se recogieron 1 × 108 células, se suspendieron en 2,5 ml de EDTA 50 mM enfriado con hielo y se almacenaron a 4 °C. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de tampón CSE (citrato fosfato 20 mM, sorbitol 1 M, EDTA 50 mM (pH 5,6)). Para preparar los esferoplastos, se añadieron a la suspensión celular 5 μL de Zymolyase 20 T (Seikagaku, Tokio, Japón, 25 mg mL-1) y 5 μL de enzima de lisis (Sigma, St. Louis, Missouri, 25 mg mL-1) y se incubaron. a 30 °C durante 20 a 50 min. Los esferoplastos se recolectaron por centrifugación a 33 × g durante 10 min a 4 °C y el sedimento se suspendió en 140 μL de tampón CSE. Se añadió a la suspensión celular un volumen igual de gel de agarosa al 1,6 % de bajo punto de fusión (Nacalai Tesque, 01161–12) precalentado a 50 °C y se distribuyó en moldes. Los tapones de agarosa se incubaron a 4 °C durante 20 min. Los tapones se incubaron en solución SDS-EDTA (1% SDS, 0,25 M EDTA) a 60 °C durante 2 h y luego en solución ESP (0,5 M EDTA, 1% N-lauroil sarcosina, 1,5 mM acetato de calcio) suplementada con 0,5 mg mL−1 de proteinasa K (Nacalai Tesque, 39450–01–6) a 50 °C durante la noche. Los tapones se transfirieron a otra solución de ESP suplementada con 0,5 mg mL−1 de proteinasa K y se incubaron a 50 °C durante 8 h adicionales. Los tapones se almacenaron en tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) a 4 °C. Los ADN cromosómicos se resolvieron usando un sistema de electroforesis de campo pulsado CHEF-DRII (Bio-Rad, Hercules, California). El PFGE se ejecutó a 4,2 V cm−1 con un tiempo de pulso de 40 a 70 s durante 24 h, a 4 °C en tampón TBE 0,5× (89 mM Tris-borato, 2 mM EDTA) utilizando gel de agarosa Megabase certificado al 0,55 %. El ADN se tiñó con 0,2 µg mL−1 de bromuro de etidio (EtBr) (Nacalai Tesque, 14631–94) y se detectó usando un escáner de imágenes de gel Typhoon FLA9000 (GE Healthcare, Chicago, Illinois) o un sistema de imágenes GelDoc Go (Bio-Rad, Hercules , CA). Las imágenes de gel se procesaron con ImageJ2 2.9.0 (NIH, Estados Unidos) o Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Se utilizó una única colonia formada en placas YE (o YE3S) después de 3 o 4 días de incubación para inocular 2 ml de medio líquido YE (o YE3S). El cultivo de 2 ml durante la noche se usó para preparar cultivos en fase logarítmica de 10 ml. Se prepararon diluciones seriadas de cinco veces de las cepas indicadas con agua esterilizada. Se colocaron 6 µl de cada dilución en placas YE (o YE3S) suplementadas con la concentración indicada de MMS, HU, CPT o TBZ. Las placas se incubaron durante 3 a 5 días a 30 °C. Las imágenes se tomaron con GT-X800 (Epson, Nagano, Japón) y se procesaron con Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Los extractos celulares se prepararon utilizando un método de lisis alcalina78. Se recogieron 1 × 108 células de cultivos YE en fase logarítmica, se lavaron con 1 ml de H2O y se suspendieron en 300 µl de H2O. Después de añadir 300 µl de NaOH 0,6 M, la suspensión celular se incubó a 30 °C durante 5 min con el tubo en rotación. Después de centrifugar a 6000 rpm durante 3 min (TOMY, MX-201), las células tratadas con álcali se suspendieron con 140 µ de tampón de muestra SDS (60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5 % de glicerol, 4 % de dodecilo de sodio sulfato, β-mercaptoetanol al 4 %, azul de bromofenol al 0,005 %) y se incubó a 95 °C durante 3 min. Los extractos celulares se recuperaron del sobrenadante después de la centrifugación a 15 000 rpm durante 1 min (TOMY, Kitman), se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8 % (SDS-PAGE) (proporción de acrilamida a bisacrilamida, 37,5:1) y se transfirieron en la membrana de transferencia de PVDF PolyScreen (Perkin Elmer, NEF1002001PK). Para detectar Chk1-HA, un anticuerpo monoclonal de ratón contra la etiqueta HA (16B12, Abcam, Cambridge, MA) (1:2000) y peroxidasa AffiniPure cabra anti-ratón IgG (pesada+ligera) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115–035− 146) (1:10.000) como anticuerpos primario y secundario, respectivamente. Las transferencias se desarrollaron usando sustrato Supersignal West Femto (ThermoScientific, 34095). Las imágenes se capturaron con ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare).

Se añadió MMS a cultivos de EMM en fase logarítmica hasta una concentración final de 0,01 %. A las 0, 2, 4, 6 y 8 h después de agregar MMS, las células se recolectaron, se suspendieron en etanol al 70 % y se almacenaron a 4 °C. Las células se suspendieron en tampón PEMS (PIPES 100 mM (pH 6,9), EGTA 1 mM, MgSO4 1 mM, sorbitol 1 M), que contenía 2 µg mL−1 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y 4 µg mL−1 calcoflúor. La suspensión celular se mezcló con un medio de montaje (90 % de glicerol, 1 mg mL-1 de galato de n-propilo, 1 mg mL-1 de diclorhidrato de 1,4-fenilendiamina, solución salina tamponada con fosfato 0,1x) en un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. . Usando un microscopio de fluorescencia (BX51, Olympus, Tokio, Japón) con un objetivo de 100x (NA = 1,40, Olympus, Tokio, Japón), se visualizaron núcleos y tabiques con DAPI y calcofluor, respectivamente. Las imágenes se obtuvieron con una cámara de dispositivo acoplado por carga (DP72, Olympus, Tokio, Japón) y se procesaron con cellSens Standard 2.3 (Olympus) y Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Se recolectaron células en crecimiento exponencial en medio EMM (Rpa2-mCherry) o YE (Rad52-GFP), se sembraron en platos con fondo de vidrio (Matsunami Glass, Osaka, Japón, D11130H) y se observaron usando un sistema de microscopía de fluorescencia DeltaVision Personal (GE Healthcare ), que se basa en un microscopio de fluorescencia de campo amplio IX71 de Olympus equipado con una cámara CCD CoolSNAP HQ2 (Photometrics, Tucson, Arizona) y una lente de objetivo de inmersión en aceite (UAPO 40×; NA = 1,35; Olympus, Tokio, Japón) . El porcentaje de núcleos con focos Rpa2-mCherry y Rad52-GFP se obtuvo contando los núcleos que contenían al menos un foco Rpa2-mCherry y Rad52-GFP, respectivamente, utilizando ImageJ2 2.9.0 (NIH, Estados Unidos). Se contaron > 300 núcleos en cada experimento. En el gráfico se mostraron tres valores experimentales independientes y sus medias usando GraphPad Prism 9 para MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA). Las imágenes se procesaron con ImageJ2 2.9.0 o Adobe Photoshop Elements 2020.

Se prepararon células en crecimiento exponencial de las cepas indicadas y se diluyeron en serie cinco veces con agua esterilizada. Se colocaron 6 µl de cada dilución en placas YE suplementadas con DMSO o 5'a-IAA 200 nM (Tokyo Chemical Industry, A3390)51. Las placas se incubaron durante 2 días. Las imágenes se tomaron con GT-X800 (Epson, Nagano, Japón) y se procesaron con Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA).

Las pruebas exactas de Mann-Whitney de dos colas y de Fischer de dos colas se realizaron con GraphPad Prism 9 para MacOS. La prueba t de Student de dos colas y la prueba Chi-cuadrado de Pearson se realizaron utilizando Microsoft Excel para Mac 16.72. El tamaño de muestra utilizado para derivar cada estadística se proporcionó en la leyenda de la figura o en la información complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se incluyen en el documento, Información complementaria (Figuras complementarias 1 a 6 y Tablas complementarias 1 a 2) y Datos complementarios 1 a 3. Los datos de la secuencia de ADN de la cepa parental y un conjunto de segregantes mutantes están disponibles en el archivo de lectura secuenciada de DDBJ con los números de acceso DRX042095 y DRX042098, respectivamente, en la siguiente URL: https://ddbj.nig.ac.jp/resource /bioproyecto/PRJDB4206. Todos los conjuntos de datos sin procesar están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

En este Artículo, la leyenda de la Figura 1 se extravió para que se superpusiera a parte de la figura. Esto ha sido corregido.

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Agradecemos a Akiko Okita, Jie Su y Yukiko Kubota por sus comentarios críticos sobre el manuscrito y a Hirofumi Ohmori y Keiko Kayahara por su asistencia técnica. También agradecemos a Adam T. Watson y Antony M. Carr por compartir el sistema AID2. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Numbers 221S0002, JP23570212, JP26114711, 18K06060, 21H02402 y Uehara Memorial Foundation Grant Number 202120462 to TN.

Estos autores contribuyeron por igual: Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan.

Departamento de Ciencias Biológicas, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japón

Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita, Keitaro Oki y Takuro Nakagawa

Centro de Investigación Forefront, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japón

Piyusha Mongia, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita y Takuro Nakagawa

Centro de Investigación de Micología Médica, Universidad de Chiba, Chiba, 260-8673, Japón

Hiroki Takahashi

División de Microbiología, Departamento de Medicina Infecciosa, Facultad de Medicina de la Universidad de Kurume, Kurume, Fukuoka, 830-0011, Japón

Yoshitoshi Ogura

Departamento de Bacteriología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Kyushu, Fukuoka, 812-8582, Japón

Tetsuya Hayashi

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PM, NT y TN concibieron el estudio. PM, NT y ZP realizaron la mayoría de los experimentos con la ayuda técnica de RX, YK, KO y TN La secuenciación profunda fue realizada por HT, YO y TH El manuscrito fue escrito por TN y PM y aprobado por todos los autores.

Correspondencia a Takuro Nakagawa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Gerben Vader y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Manuel Breuer. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mongia, P., Toyofuku, N., Pan, Z. et al. La levadura de fisión Srr1 y Skb1 promueven la formación de isocromosomas en el centrómero. Commun Biol 6, 551 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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Recibido: 14 Octubre 2022

Aceptado: 09 mayo 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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