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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21424 (2022) Citar este artículo
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La pandemia de coronavirus acentuó la necesidad de pruebas de diagnóstico molecular. Una técnica muy utilizada para este fin es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica sensible y específica comúnmente utilizada como estándar de oro para el diagnóstico molecular. Sin embargo, exige personal altamente capacitado y equipo de alto mantenimiento y requiere relativamente mucho tiempo. Una alternativa es la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), que no necesita purificación de la muestra ni equipo costoso, y es similar a la PCR cuando se compara en sensibilidad y especificidad. En este artículo, desarrollamos una prueba colorimétrica optimizada de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcriptasa inversa (RT-LAMP) en el punto de atención utilizando un dispositivo portátil para diagnosticar COVID-19. Se probaron variables como concentración de cebadores, sulfato de magnesio, betaína, clorhidrato de guanidina, Bst y temperatura de las reacciones. También creamos un sistema de control de calidad de pipeteo, utilizando una combinación de colorantes, para evitar falsos negativos debido a la falta de muestras añadidas al tubo de ensayo de reacción. Se incorporó aceite mineral en la composición de las reacciones RT-LAMP para evitar la evaporación cuando no se dispone de una tapa calefactora. La prueba final RT-LAMP es diez veces más sensible en comparación con la mezcla maestra colorimétrica WarmStart de New England Biolabs con una sensibilidad de 5 copias por μL.
En diciembre de 2019, el mundo fue testigo del resultado de un nuevo coronavirus, llamado Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus 2, o SARS-CoV-2. El primer caso de infección por SARS-CoV-2 se reportó en Wuhan, China, y pronto se propagó por todo el globo, siendo notificada como nueva pandemia en marzo de 20201. El estallido de la pandemia reveló la necesidad mundial de biología molecular pruebas para identificar, aislar y tratar a las personas infectadas como medio para controlar la propagación de la enfermedad.
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)2 se conoce comúnmente como la técnica estándar de oro para las pruebas moleculares de los virus de ARN, como el SARS-CoV-2. La RT-PCR es una técnica con alta sensibilidad y especificidad, pero requiere equipos de alto costo y mantenimiento, extensos pasos de purificación de muestras y personal altamente capacitado. Con el rápido aumento de personas infectadas, se hizo evidente la falta de reactivos, insumos, personal y equipos para las pruebas moleculares, y el mundo experimentó escasez de recursos de laboratorio para satisfacer la demanda.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) fue descrita por primera vez por Notomi y sus colegas en 20003 como una técnica de amplificación de ácidos nucleicos con alta especificidad y eficiencia, capaz de realizarse en condiciones isotérmicas. Utiliza una polimerasa de ADN de desplazamiento de cadena (privada de actividad de exonucleasa 5 '→ 3') y un conjunto de dos o tres pares de cebadores diseñados para crear bucles en el ADN monocatenario sintetizado. Cada vez que la polimerasa inicia una nueva amplificación, libera la hebra de ADN previamente emparejada, que forma una estructura de bucle que contiene nuevos sitios de unión para la polimerasa, creando así una amplificación autopropagante. Los productos finales de la reacción son estructuras parecidas a coliflores con múltiples bucles formados por hibridación entre repeticiones alternadamente invertidas del objetivo3. Además de en la PCR, las reacciones LAMP también pueden combinarse con una enzima transcriptasa inversa para realizar la amplificación de moléculas de ARN.
El alto grado de síntesis de ADN que se produce en las reacciones LAMP permite la detección visual de una reacción positiva. Cada vez que la ADN polimerasa incorpora un dNTP en la hebra de ADN recién sintetizada, libera un pirofosfato y una molécula de protón como subproducto. El pirofosfato, en presencia de iones Mg2+, precipita como pirofosfato de magnesio cambiando la turbidez de la reacción. El protón liberado disminuye el pH de la reacción, lo que puede detectarse mediante el uso de un colorante colorimétrico sensible al pH, como el rojo de fenol y el azul de bromotimol4,5.
Las pruebas isotérmicas colorimétricas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) han desempeñado un papel central en la respuesta a la pandemia de COVID-19. Más allá del hecho de que no requieren un termociclador, el procesamiento de muestras también se simplifica6 y los resultados se pueden determinar a simple vista. Estas técnicas se han aplicado con éxito a los entornos de punto de atención y tratamiento (POCT), con sensores digitales que ayudan al control y el análisis de la reacción. Más allá de la configuración simple, la RT-LAMP colorimétrica también se puede usar en pruebas de diagnóstico POCT con detección RGB (rojo, verde, azul) para una mayor precisión y excluye la necesidad de filtros y detectores expansivos. El análisis de los datos del transcurso del tiempo puede generar curvas de amplificación similares a las de los sistemas fluorescentes7.
Aquí realizamos un desarrollo sistemático de un ensayo colorimétrico RT-LAMP dirigido al SARS-CoV-2, optimizado para su uso en el dispositivo Hilab® Molecular POCT, incluido el ajuste fino de la concentración del reactivo, los procedimientos de control de calidad para el operador, la gestión de la evaporación y la estabilidad. .
La matriz experimental completa estuvo compuesta por 192 condiciones diferentes (Tabla S1). Se definió un modelo para cada parámetro de respuesta, tanto para las reacciones positivas como para las negativas, y se mantuvieron o eliminaron los factores en base a un gráfico de Pareto de los efectos estandarizados, con alfa (α) = 0,05. Realizamos los experimentos con una sola réplica y los valores atípicos se eliminaron manualmente en función de la forma de la curva y los resultados esperados. La Figura 1 ilustra el análisis de los resultados del experimento, incluidos los perfiles de residuos y las gráficas de probabilidad normal. El ajuste del modelo se consideró aceptable debido al perfil de distribución de residuos. El ANOVA de los modelos se puede encontrar en la Fig. 2, y la Fig. 3 ilustra la optimización de la respuesta con el objetivo de minimizar el tiempo inicial de amplificación (Xt) y el tiempo de reacción (TTR), el tiempo para lograr el 50 % del delta de amplificación. — de reacciones positivas y minimizar el Nmax (Delta del cambio de color entre el color inicial y final de la reacción) de reacciones negativas.
Análisis de los resultados del experimento con el objetivo de minimizar la respuesta del Tiempo de Reacción (TTR) de las reacciones positivas, obtenidos con el software Minitab. En (A) Parcelas residuales. La gráfica de probabilidad normal representa que los residuos analizados se distribuyen normalmente. El histograma representa la distribución de los residuos. La gráfica de residuos versus ajustes muestra que los residuos se distribuyen aleatoriamente, y la gráfica de residuos versus orden indica los residuos en el orden en que se recolectaron los datos, mostrando que los residuos son independientes ya que no hay patrones en el orden de observación. (B) Gráfico de probabilidad normal con α = 0.05, donde los factores significativos, en orden, fueron: secuencia de cebador (F), concentración de Bst (B), concentración de cebador (A), concentración de sulfato de magnesio (C) y la combinación de secuencia de cebadores y ajuste de pH de clorhidrato de guanidina (FG).
ANOVA de la respuesta TTR obtenida del software Minitab con los factores probados y el respectivo P-valor. Los factores como la concentración del cebador ([Primer]), la concentración de Bst ([Bst]), la concentración de sulfato de magnesio ([MgSO4]) y la secuencia del cebador (Primer) fueron estadísticamente significativos, p < 0,05.
Optimización de respuesta obtenida de Minitab al minimizar la positividad inicial (Ini_post) y TTR (TTR_post) de reacciones positivas, y minimizando Nmax (Color Delta) de reacciones negativas con la deseabilidad de 0.989. Para lograr la respuesta óptima, el modelo final fue un cebador a una concentración, Bst a 0,4 U/μL (equivalente al 50 %), sulfato de magnesio a 8 mM, betaína a 400 mM, cebadores dirigidos a la secuencia N y Orf1ab, y una temperatura de 67 ºC
El modelado de los resultados de la respuesta TTR de las reacciones positivas produce la secuencia del cebador, la concentración de la enzima, el sulfato de magnesio y la concentración del cebador como factores significativos, en este orden. El modelado para la determinación manual del inicio de la amplificación (Xt) y el punto de inflexión usando regresión no lineal fue esencialmente el mismo. Se realizó una optimización para minimizar las variables de respuesta modeladas y se usaron gráficos factoriales y de deseabilidad para determinar los rangos de interés para los factores analizados. Se encontró que la concentración de cebador en una vez (el valor máximo probado) era óptima, con concentraciones más bajas causando un aumento en los valores de TTR. Las temperaturas más altas tuvieron un efecto positivo en los tiempos de reacción. El tipo de secuencia del cebador fue peor para el par de NE y aproximadamente igual para las dos combinaciones restantes, mientras que el ajuste del pH de la solución madre de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) parece tener poco o ningún efecto en las respuestas evaluadas.
También se aceptó el modelo para la Nmax de reacciones de control negativo, con R2 de 67,28%. Los gráficos factoriales del modelo indican una propensión a la amplificación no específica para concentraciones aumentadas de polimerasa y sulfato de magnesio. Se observa una relación inversa entre la concentración de betaína. Las temperaturas más bajas, como se esperaba, aumentan las posibilidades de amplificación no específica.
A través del software Minitab, podemos considerar los tres modelos—minimizar TTR y tiempo inicial de amplificación (Xt) de reacciones positivas y minimizar Nmax de reacciones negativas—en cuenta para tomar la mejor decisión para cada variable analizada. Con Minitab, podemos agregar la importancia de cada respuesta analizada para brindar un mejor ajuste teniendo en cuenta todos los parámetros de respuesta. Aquí, a las tres respuestas se les da la misma importancia (un peso de 1), sin embargo, considerando que en dos de las tres respuestas analizadas, el parámetro tiempo (TTR y tiempo inicial) cuenta como \({\raise0.5ex\hbox{ $\scriptstyle 2$} \kern-0.1em/\kern-0.15em \lower0.25ex\hbox{$\scriptstyle 3$}}\) del resultado para elegir las variables. Teniendo en cuenta los tres modelos, el software sugiere los niveles óptimos. Los mejores factores después de esta ronda de optimización fueron una concentración de cebador, 0,5 veces de Bst (0,4 U/μL), 8 mM de sulfato de magnesio y 400 mM de betaína, con una temperatura de reacción de 67 °C. La combinación de cebadores elegida fue la 1AN (gen N y secuencia Orf1ab).
Usando la condición optimizada mencionada anteriormente, no observamos resultados falsos positivos incluso después de una amplificación de 60 minutos (archivo complementario).
Los rangos de pH de cambio de color para cada colorante indicador probado se muestran en la Tabla 1.
Analizamos los indicadores de pH en función de la complejidad para preparar las soluciones madre, la estabilidad en el tiempo y las temperaturas, la precipitación del colorante y el rango de pH frente al cambio de color. Evaluamos los colorantes en el dispositivo Molecular HilabⓇ en varios volúmenes de reacción ya que pueden influir en la saturación del color. Según el fabricante, la enzima Bst es estable en pHs de 5 a 10, los tintes que estaban fuera de este rango o demasiado cerca de los límites alto y bajo se descartaron como indicadores potenciales. La Figura S1 muestra el gradiente de color para cada tinte indicador de pH probado.
El púrpura de metacresol no se disolvió completamente en agua ultrapura libre de nucleasas tipo 1 o tampón TE, por lo que se descartó de las pruebas posteriores. Dado que el dispositivo Molecular HilabⓇ muestra el resultado de la reacción como una serie de tiempo de color, el uso de colorantes indicadores de pH que comienzan como una solución incolora podría interpretarse como una falta de inserción de los tubos de reacción. Por ello, se descartaron como indicadores potenciales la o-cresolftaleína y la α-naftolftaleína.
El azul de bromotimol y el púrpura de bromocresol mostraron un buen cambio de color (de azul profundo y púrpura a amarillo, respectivamente) y estabilidad. El rojo de cresol y el rojo de clorofenol tuvieron resultados similares al rojo de fenol, que ya se usa en la mezcla LAMP Master de NEB. Después de la selección, el azul de bromotimol fue elegido como el indicador de pH más estable, exhibiendo un gran cambio de color, de azul a amarillo, lo que corresponde a una diferencia de 180° en la escala de tonos. La concentración óptima de azul de bromotimol en la reacción de RT-LAMP se probó y definió a 100 μM, ya que las concentraciones por debajo dieron como resultado un color azul claro y por encima aumentaron el TTR de la reacción (datos no mostrados).
Probamos la adición de 1–4 µL de KOH 10 mM (hidróxido de potasio) para evaluar la influencia del pH inicial de la reacción. Los parámetros analizados fueron TTR y Nmax. Curiosamente, no se observaron diferencias significativas en ambos parámetros. Sin embargo, la condición con el TTR más bajo y el Nmax más alto se obtuvo con 1,2 mM de KOH en la reacción final. El Nmax fue de aproximadamente 54 (± 4) con un TTR de 420 s cuando se usó un control positivo (1 × 106 equivalentes de genoma/reacción) (Fig. S2).
Como prueba Point-of-Care, nuestro objetivo era desarrollar un kit que minimizara y simplificara la manipulación para el operador. Con el objetivo de facilitar el procedimiento, probamos algunas combinaciones de colorantes en la solución de muestra. Al hacerlo, el operador podría ver si la muestra se agregó al tubo de reacción y si el volumen pipeteado fue correcto, evitando resultados falsos negativos por falta de adición de muestra. Dado que trabajos anteriores habían demostrado que se podía utilizar una combinación de colorantes indicadores de pH en las reacciones LAMP8, probamos la combinación de azul de bromotimol con rojo de fenol o rojo de cresol en nuestras reacciones.
La combinación de azul de bromotimol y rojo de cresol resultó en un color azulado fangoso después de la adición de la muestra (Fig. 4—tubos 25–32). Después de una amplificación de 30 minutos, el color en los tubos de control positivo (33–35 y 37–39) se pudo distinguir ligeramente de los controles sin plantilla (NTC) (tubos 36 y 40). El rojo de fenol fue elegido como el mejor colorante para ser utilizado en la composición de la solución de la muestra. Después de agregar la muestra, el color de la reacción pasó de azul (tubos 1 a 8) a morado (tubos 9 a 16), siendo un cambio de color perceptible para el operador. En el caso de la amplificación el color final fue amarillo brillante (tubos 17-19; 21-23) y se distinguió claramente de los tubos NTC (20 y 24) (fig. 4). Además, pudimos obtener Nmax y TTR (< 600 s) satisfactorios con la combinación de los colorantes.
Reacciones con diferentes colorantes antes y después de la incubación a 67 °C durante 30 min. Los tubos 1 a 8 contenían solo azul de bromotimol, que mostraba el color de la reacción antes de agregar la muestra. Las soluciones de muestra contenían rojo de fenol o rojo de cresol. Los tubos 9–16 representan los tubos 1–8 después de la adición de la muestra con una solución que contiene rojo de fenol, y los tubos 17–24 son después de la incubación a 67 °C durante 30 min. Los tubos 25–32 representan los tubos 1–8 después de la adición de la muestra con una solución que contenía rojo de cresol, y después de una incubación a 67 °C durante 30 min, los resultados fueron los tubos 33–40. Los tubos 12, 16, 28 y 32 eran controles sin plantilla. La concentración final de tintes en los tubos fue: los tubos 1 a 4 contenían azul de bromotimol 50 μM; 5–8 contenían azul de bromotimol 100 μM; 9-12 y 17-20 contenían azul de bromotimol 50 μM y rojo fenol 100 μM; 13-16 y 21-24 contenían azul de bromotimol 100 μM y rojo fenol 100 μM; 25-28 y 33-36 contenían azul de bromotimol 100 μM y rojo de cresol 100 μM; 29-32 y 37-40 contenían azul de bromotimol 50 μM y rojo de cresol 100 μM.
No observamos ninguna reacción de falso positivo en una amplificación de 30 min.
Teniendo en cuenta que la reacción LAMP colorimétrica utilizada en este artículo depende del pH, debemos analizar si el pH de la solución de muestra podría interferir con los parámetros de reacción como Nmax y TTR. Las soluciones de muestra se probaron en cinco pH diferentes que oscilaban entre 7 y 9, con un aumento de 0,5. Sin ningún ajuste, la solución tenía un pH de aproximadamente 8,5, por lo que tuvimos que agregar NaOH o HCl para lograr el pH deseado. Después de agitar una muestra de hisopo nasofaríngeo en la solución, verificamos que el color rosa se intensificó, lo que indica cierta basificación.
Todas las reacciones se volvieron positivas cuando se probaron con cebadores de control interno para rActina humana (Tabla S2), sin embargo, un pH más alto de la solución de muestra provocó un aumento en el TTR, como se esperaba (Tabla S3). Las soluciones de muestra con un pH de 7,0 a 7,5 mostraron una mayor consistencia entre las réplicas y valores de TTR más bajos (642 ± 54 y 714 ± 24 s, respectivamente).
Las reacciones colorimétricas que dependen del cambio de pH no son compatibles con las soluciones tampón y, por lo general, solo contienen residuos de los tampones de almacenamiento de enzimas. Sin embargo, hemos notado que cuando se usan enzimas altamente concentradas (soluciones madre a 120 U/μL), por lo que tienen un arrastre de tampón más bajo, las reacciones que contienen azul de bromotimol se acidifican rápidamente. Unos 15 minutos en hielo fueron suficientes para provocar un cambio visible en el color de la reacción de azul a verdoso. Probamos si había una concentración óptima de Tris que evitaría el cambio de color durante la preparación de los tubos sin interferir con el paso de amplificación. Analizamos el valor delta (Nmax) y el tiempo inicial de amplificación (Xt) obtenidos en cada condición justo después de la producción de la mezcla de reacción.
Fue posible observar que con el aumento de la concentración de Tris, el tiempo inicial de amplificación también aumentó (Fig. S3). Debido a la característica amortiguadora de Tris entre el rango de pH de 6 a 8, el pH de las reacciones y, en consecuencia, el color de la misma, fueron más difíciles de cambiar a medida que la concentración de Tris era mayor. La concentración de Tris y el Nmax fueron inversamente proporcionales, una mayor cantidad de Tris resultó en un menor delta (Nmax) del color de la reacción en comparación con la concentración más baja de Tris probada (510 μM).
No hubo una diferencia significativa con los diferentes métodos de agregar la muestra, es decir, la presencia del aceite mineral no fue un problema al agregar la muestra a la reacción. Además, en las condiciones en las que se añadieron 0 o 5 μL de aceite mineral a la reacción, aún se producía evaporación, ya que se podían observar pequeñas gotas en la tapa del microtubo y disminuía el volumen en el fondo del microtubo (Fig. 5). Observamos que sin el aceite mineral no era posible lograr una estabilización de la Nmax ya que la evaporación ocurría durante la amplificación, aumentando la saturación del color capturado, lo que lleva a una mayor Nmax.
Efecto del aceite mineral tras la amplificación a 67 °C durante 60 min. En los tubos 1, 2 y 7 no hubo adición del aceite mineral; los tubos 3 y 4 recibieron 5 μL de aceite mineral y los tubos 5, 6 y 8 recibieron 10 μL de aceite mineral. Los tubos 1–6 recibieron control positivo de SARS-CoV-2 y los tubos 7 y 8 fueron controles negativos.
El protocolo final se estableció con la adición de 12 μL de aceite mineral a una reacción de 20 μL, ya que no se observaron gotas en la tapa del microtubo (el volumen en el fondo del tubo se mantuvo igual durante toda la prueba) y fue posible para lograr una estabilización del valor de Nmax. No observamos una diferencia significativa en TTR o sensibilidad cuando se agregó aceite mineral a la reacción.
El límite se estableció en 5 equivalentes de genoma por μL con un 100% de positividad (10/10) con una Nmax media de 54 (± 26) y el tiempo inicial de amplificación (Xt) de aproximadamente 1302 s (± 396) (fig. 6 y figura S4). Se están ejecutando más experimentos que simulan el transporte y el almacenamiento para analizar si la sensibilidad de la prueba sigue siendo la misma.
Límite de detección de la prueba utilizando una solución de control que contiene plásmidos pUC57 clonados con las secuencias de ADN sintético correspondientes a los sitios del gen N o Orf1ab. (A) En el eje x está la dilución de la solución de control en copias por reacción en Log y el eje y es el Xt (tiempo inicial de amplificación en segundos) de las reacciones. (B) En el eje x está la dilución de la solución de control en copias por reacción y el eje y es el Nmax de la reacción.
En la Tabla 2, resumimos la composición optimizada del tampón de reacción y la solución de muestra. Las muestras de hisopos nasofaríngeos pueden inactivarse con calor a 95 °C durante 10 min o añadirse a la reacción sin ningún tratamiento. Después de la adición de la muestra, la amplificación debe realizarse a 67 °C durante 30 min.
Las reacciones colorimétricas RT-LAMP han revolucionado las pruebas POCT moleculares, permitiendo una instrumentación económica con alta sensibilidad y especificidad, características de los ensayos moleculares como qPCR9. Aunque se usa comúnmente debido a su fácil diferenciación entre reacciones negativas y positivas mediante la observación a simple vista, las reacciones colorimétricas también permiten la sustitución de fluoróforos costosos e inestables y configuraciones de filtros para sistemas de adquisición de datos más simples. En nuestro estudio, hemos utilizado el dispositivo Molecular Hilab®, que cuenta con una detección RGB junto con LED blancos y conectividad a Internet a través de WiFi o USB, lo que proporciona un monitoreo simultáneo de la reacción y una evaluación remota del ensayo por parte de profesionales de la salud. En el presente estudio, hemos desarrollado una formulación novedosa optimizada para el análisis de pruebas POCT remotas, utilizando el dispositivo Molecular Hilab®.
La cuantificación de material genético amplificado por reacciones de qPCR se puede medir por ciclos de temperatura, donde la cantidad de ADN se duplica en cada ciclo, lo que facilita interpretar el progreso de la reacción y estipular la carga de muestra inicial. Por otro lado, las reacciones de RT-LAMP ocurren a una sola temperatura y tienen una cinética compleja en comparación con qPCR. Sin embargo, las reacciones LAMP colorimétricas se pueden describir como parámetros como el tiempo de reacción (TTR), el tiempo inicial de amplificación (Xt) y el cambio de color máximo (Nmax). No obstante, hemos demostrado que estos parámetros siguen siendo útiles para el modelado empírico de una medición cuantitativa de la tasa de amplificación utilizando DoE. Se obtuvieron condiciones aceptables para cinco variables continuas y dos categóricas, con alrededor de 200 condiciones de prueba no replicadas. Incluso con la eliminación de valores atípicos, los modelos obtenidos fueron aceptables y se utilizaron con éxito para obtener condiciones optimizadas para nuestras condiciones de ensayo específicas.
Entre todos los parámetros analizados, observamos que la secuencia del cebador —que apunta al gen N, ORF1ab o E—, Bst, cebador y sulfato de magnesio fueron los más significativos (α = 0,05). Esto es coherente con otros artículos que probaron la optimización de componentes, que también observaron que el aumento de la enzima y la concentración de MgSO410,11 mejoraba el rendimiento de la reacción. En nuestro caso, la mejor concentración fue 0,4 U/μL de Bst y 8 mM de MgSO4. La mezcla maestra WarmStart de NEB para SARS-CoV-2 (que contiene la polimerasa de ADN Bst 2.0) recomienda un rango de Tris de 0,5 y 5 mM12, descubrimos que la concentración más baja de Tris que se podía lograr (510 μM) da una menor TTR. Esto está de acuerdo con las características tamponadoras de Tris ya que la reacción tiene que estar débilmente tamponada para permitir el cambio de color del colorante dependiente del pH. También recomiendan que el pH de la mezcla maestra esté entre 7,5 y 9,0. Probamos la concentración de KOH para definir un pH inicial de la reacción que dé un TTR más bajo y un Nmax más alto. Vimos que las concentraciones de KOH probadas no tenían una diferencia estadísticamente significativa en el TTR o Nmax, aunque una concentración final de 1,2 mM dio un cambio de color ligeramente mejor (Nmax). También abordamos el ajuste de pH de la solución de muestra midiendo el TTR y Nmax de la reacción justo después de su preparación y por la disminución de su pH con el tiempo. Una solución de muestra con un pH entre 7 y 7,5 muestra un menor TTR de la reacción y tiene una mejor estabilización del pH durante el almacenamiento. Además, un pH más alto demostró una reducción significativa del pH durante unas pocas semanas de almacenamiento (datos no mostrados).
Se ha demostrado que el clorhidrato de guanidina pH 8,0 mejora la reacción LAMP13. Observamos que el ajuste del pH Gu-HCl a 8,0 no tuvo un impacto significativo en el TTR o Nmax de la reacción. Además, el pH de Gu-HCl disminuyó con el tiempo, lo que es incompatible con un almacenamiento prolongado, y un ajuste justo antes del uso es incongruente con una prueba POC. Otro aditivo probado fue la betaína, que se ha utilizado en técnicas de PCR y LAMP para mejorar la especificidad del ensayo14,15. Usando una concentración de betaína 400 mM, no observamos una amplificación inespecífica, a diferencia de lo observado en otro estudio15.
Se ha probado previamente una combinación de colorantes en la mezcla de reacción para expandir la aplicación de colorimetría LAMP8, sin embargo, aquí usamos la combinación de diferentes colorantes como control de pipeteo para garantizar que el operador haya agregado la muestra al tubo de reacción, evitando falsos negativos por falta de adición de muestra. La solución de muestra contiene rojo de fenol y, después de agregar la muestra a la mezcla de reacción, que contiene azul de bromotimol, el color se vuelve púrpura. El control de calidad de las pruebas realizadas a distancia es de suma importancia, especialmente en el caso del diagnóstico molecular. La inclusión del tinte en el tampón de la muestra no parece afectar la eficiencia del tratamiento de la muestra y es poco probable que afecte la inactivación por calor. Entre los ocho colorantes probados, elegimos el colorante azul de bromotimol para componer la mezcla de reacción y el colorante rojo de fenol para la solución de muestra. La inversa (rojo fenol en la mezcla de reacción y azul de bromotimol en la solución de muestra) no se aprobó porque la solución de muestra se volvería más oscura y poco atractiva como producto de diagnóstico. Ambos colorantes fueron estables, con un rango de pH compatible con nuestra reacción y el cambio de color se detectó mejor en el sistema RGB. Además, estos dos colorantes han sido ampliamente utilizados en reacciones LAMP colorimétricas4,8,16,17.
El dispositivo molecular Hilab® no cuenta con una tapa calentada para facilitar la producción y aumentar la robustez al reducir la cantidad de piezas móviles. Sin embargo, esto hace que las reacciones sean susceptibles a una evaporación excesiva, lo que lleva a una posible interpretación errónea de las reacciones colorimétricas provocadas por el aumento de la saturación de color. Para mitigar este problema, se probó aceite mineral para PCR para evitar la evaporación18. Hemos encontrado que la adición del aceite puede inhibir completamente la evaporación y estabilizar el color, sin efectos perjudiciales para la señal o el tiempo de reacción. La presencia de aceite mineral no ha afectado el proceso de transferencia de muestras, ya sea que se haya agregado encima o debajo de la capa de aceite mineral. Homogeneizar la solución con una pipeta o golpeando los lados del tubo tampoco afectó la eficiencia de la reacción. La capa de aceite se restableció después de unos segundos. El aceite mineral se puede añadir de antemano y la reacción se puede congelar con el aceite. Además de eso, el aceite permite que la reacción se lleve a cabo en configuraciones más simples, por ejemplo, en un bloque seco.
El límite de detección (LoD) alcanzado fue de 5 copias por μL con un 100 % de positividad utilizando un control sintético, similar a otro ensayo RT-LAMP19. Los experimentos anteriores realizados en nuestro laboratorio con WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix de NEB con cebadores dirigidos a los genes N y E del SARS-CoV-2 no pudieron alcanzar un límite de detección por debajo de 50 copias por μL (datos no mostrados). El límite de detección de las pruebas de RT-PCR con muestras purificadas varía entre 0,0819 y 1420 copias por μL21,22,23. Al comparar nuestro LoD con otras pruebas moleculares que utilizan un hisopo directo, nuestro límite de detección fue de 25 000 copias por ml cuando el LoD de las pruebas comerciales fue de 60 000 a 540 000 NDU por ml24: las copias de ARN viral/ml equivalen a los equivalentes de copias del genoma/ml ( GCE/mL) o unidades detectables de ácido nucleico/mL (NDU/mL)25. Los resultados obtenidos no se compararon con el ensayo RT-qPCR ya que nuestra técnica utiliza muestras no purificadas.
Aún deben ejecutarse pruebas de estabilidad para verificar si el LoD sigue siendo el mismo después de un largo período de almacenamiento. También se requiere la validación clínica de la prueba utilizando muestras de pacientes positivas para COVID-19.
Es importante tener en cuenta que los resultados encontrados aquí se lograron usando 4 μL de solución de muestra para un volumen de reacción final de 20 μL. Los resultados pueden ser diferentes si cambia la proporción de muestra añadida o la composición de la solución de muestra. Además de eso, aunque aumentar el volumen total de la reacción puede mejorar la sensibilidad26, esto puede aumentar el costo de la prueba.
Aquí hemos optimizado con éxito las condiciones de reacción para la detección colorimétrica de ácidos nucleicos en entornos POCT, con una sensibilidad diez veces mayor en comparación con la mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP de NEB. Nuestra receta de mezcla maestra puede maximizar las diferencias de señal de color, minimizar el tiempo de amplificación de las secuencias objetivo, controlar la adición de muestras y puede usarse en un entorno refrigerado. También es capaz de adaptarse a tiempos de reacción más largos sin evaporación del volumen, incluso sin el uso de una tapa calentada, gracias a la adición de aceite mineral. La amplificación no específica también se mitigó mediante la optimización de la Metodología de superficie de respuesta (RSM). Estas mejoras permitirán pruebas de detección más rentables en una amplia gama de configuraciones posibles.
Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase (M0538), Antarctic Thermolabile UDG (M0372), WarmStart® RTx Reverse Transcriptase (M0380), así como dNTP (N0446S y N0459S) se adquirieron de New England Biolabs (NEB). Rojo de fenol (114529), Aceite mineral (M5904), Cloruro de potasio (P9541), Hidróxido de potasio (P5958), Sulfato de magnesio (M3409), Tween-20 (P9416), Clorhidrato de guanidina (G3272), Clorhidrato de tris (93363) y La betaína (B0300) se adquirió de Sigma-Aldrich. El agua ultrapura tipo I (10977) y el tampón TE pH 8,0 (93283) se adquirieron de Invitrogen. Los colorantes Azul de bromotimol (AB08416RA), Rojo de cresol (VC09256RA), Rojo de clorofenol (VC06226RA), Púrpura de bromocresol (PB06593RA), Púrpura de metacresol (PM06383RA), α-naftolftaleína (AN07911RA) y O-cresolftaleína (C05368RA) fueron adquiridos de Êxodo Científica .
Las secuencias de cebadores utilizadas se dirigieron al gen N, los genes E13 o la secuencia Orf1ab27 del SARS-CoV-2. Se utilizó un conjunto de cebadores dirigidos a la secuencia de ARNm de ACTB humana como control interno (Tabla S2). Los cebadores se solicitaron a Exxtend con purificación por HPLC y se resuspendieron a 200 μM en agua ultrapura sin nucleasa de tipo 1. Para facilitar el pipeteo, los cebadores se prepararon como una mezcla de cebadores concentrada diez veces. La mezcla de cebadores de control interno estaba constituida solo por cebadores ACTB, mientras que la mezcla de cebadores SARS-CoV-2 estaba compuesta por una combinación de dos conjuntos de cebadores dirigidos a genes N y E, genes N y Orf1ab o genes E y Orf1ab. Cada mezcla tenía cebadores FIP y BIP 16 μM, cebadores F3 y B3 2 μM y cebadores de bucle 4 μM para cada objetivo utilizado.
Los controles positivos liofilizados se obtuvieron de GenScript y consistieron en plásmidos pUC57 clonados en el sitio EcoRV con el gen N, el gen E o la secuencia Orf1ab del SARS-CoV-2 (Tabla S2). Los controles positivos se diluyeron con agua libre de nucleasa tipo 1 ultrapura hasta una concentración intermedia y luego se mezclaron con la solución de muestra (descrita a continuación) para lograr una concentración final de 106 copias/μL de cada objetivo.
La solución de muestra, a menos que se indique lo contrario, constaba de tampón TE al 10 %, pH 8,0 (Tris 10 mM y EDTA 1 mM), Tween-20 al 0,1 % y rojo fenol 500 μM. La solución de muestra se añadió a la reacción en un volumen de 4 μL para obtener una concentración final de 100 μM del colorante colorimétrico.
En los experimentos en los que usamos cebadores dirigidos al ARNm de ACTB, personal capacitado recolectó muestras de hisopos nasofaríngeos (NP) de voluntarios asintomáticos. A continuación, las muestras recogidas se agitaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenía 500 μl de solución de muestra y se inactivaron térmicamente a 95 °C durante 10 min. Todas las muestras utilizadas en este estudio se obtuvieron bajo la firma de términos de consentimiento libre y aclarado.
Las reacciones de RT-LAMP se llevaron a cabo, a menos que se indique lo contrario, con una concentración final de cebadores FIP y BIP 1,6 µM, cebadores F3 y B3 0,2 µM y cebadores loop 0,4 µM de cada gen diana. También estaban presentes dNTP 1,4 mM (dATP, dCTP, dGTP 1,4 mM y dTTP, dUTP 0,7 mM), 0,4 U/μL de Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase, 0,3 U/μL de WarmStart® RTx Reverse Transcriptase, 0,005 U/μL Antártida UDG termolábil, betaína 400 mM, clorhidrato de guanidina 40 mM pH 8,0, KCl 10 mM, MgSO4 8 mM, Tween-20 al 0,1 % (v/v), azul de bromotimol 100 μM y 4 μL de la solución de muestra, con un total reacción de 20 μL.
El protocolo de reacción probado se fijó a 67 °C durante 30 min, a menos que se indique lo contrario. Dado que la reacción tiene dos indicadores de pH incluidos, azul de bromotimol y rojo de fenol, la lectura de un resultado positivo o negativo se tomó por el cambio de color en los tubos. En el caso de una reacción positiva, el color inicial cambiaba de púrpura a amarillo por la disminución del pH de la reacción, causada por la liberación de protones a medida que se incorporaban dNTP a la cadena de ADN recién sintetizada.
Para determinar los parámetros óptimos para nuestra formulación personalizada de RT-LAMP, se adoptó un enfoque de diseño de experimentos. Elegimos una Metodología de superficie de respuesta (RSM) para ajustar el valor de cinco factores continuos (ADN polimerasa, sulfato de magnesio, cebadores y concentraciones de betaína, así como la temperatura de reacción) y dos factores categóricos (ajuste de pH del clorhidrato de guanidina [ sí/no] y combinación de secuencias de cebadores [N/E, N/Orf1ab o E/Orf1ab]). Los niveles altos y bajos de betaína y sulfato de magnesio se modelaron como concentraciones milimolares, mientras que las concentraciones de cebador se modelaron como fracciones de la receta estándar. Las concentraciones de polimerasa se modelaron como fracciones a partir de una concentración máxima de 0,8 U/μL. Los niveles alto y bajo de la reacción de temperatura se establecieron como + 2 ° o - 2 ° desde la temperatura original de 65 °C.
Se utilizó Minitab 19 para generar la matriz experimental, aleatorizar el orden de ejecución y analizar los datos. Para cada condición, utilizamos una reacción de control positiva (1 × 106 equivalentes de genoma/reacción) y una negativa para medir la eficiencia de la reacción y las tasas de amplificación no específicas para cada condición. Los factores de respuesta analizados fueron el tiempo de reacción (TTR), Nmax y el tiempo inicial de amplificación (Xt) tanto para las reacciones positivas como para las negativas.
Con base en la literatura publicada28,29, probamos otros colorantes indicadores de pH como azul de bromotimol, rojo de fenol, rojo de cresol, rojo de clorofenol, púrpura de bromocresol, púrpura de metacresol, α-naftolftaleína y O-cresolftaleína en concentraciones finales que oscilan entre 50 y 200 μM . Las soluciones madre se prepararon como 2 mM del colorante en tampón TE 1 mM y se diluyeron a la concentración deseada con agua ultrapura libre de nucleasas de tipo I. Los gradientes de pH se obtuvieron mezclando los colorantes colorimétricos con NaOH 1 M o HCl.
Dado que nuestra prueba RT-LAMP depende del pH, planteamos la hipótesis de que el pH inicial de la solución podría afectar el TTR o el Nmax de la reacción. Para verificar esto, probamos el pH inicial óptimo de la reacción, ajustándolo con KOH 10 mM a una concentración final de KOH 0,4-1,6 mM. Los tubos contenían cebadores dirigidos a los genes N y Orf1ab y controles positivos como se describe anteriormente.
Probamos una combinación de azul de bromotimol con rojo de cresol y rojo de fenol en concentraciones finales que oscilan entre 50 y 200 μM, tanto en la muestra como en la solución de reacción. Se utilizó como muestra un hisopo nasofaríngeo recogido, y las reacciones tenían cebadores dirigidos al ARNm de ACTB. Los controles sin plantilla estaban constituidos únicamente por solución de muestra. El tinte se seleccionó en función del cambio de color después de agregar la muestra a la reacción LAMP y al final de la reacción positiva.
Preparamos soluciones de muestra en pH que oscilan entre 7 y 9 con un aumento de 0,5 entre condiciones. Cada condición de pH tenía 1 tubo como control negativo y un triplicado técnico con muestras de hisopos nasofaríngeos. Los tubos contenían cebadores dirigidos al ARNm de ACTB.
Dado que nuestro protocolo se basó en el cambio de la reacción de pH, probamos la concentración ideal de Tris en la reacción final. Las enzimas utilizadas en la reacción LAMP y los reactivos de la solución de muestra contenían Tris en sus composiciones, por lo que la concentración mínima de Tris que se pudo lograr en la reacción fue de 510 μM, la concentración más baja probada, y la más alta de 1000 μM (NEB afirma que su mezcla maestra Warmstart® RT-LAMP funciona con hasta 1000 μM de Tris). Se agregaron diferentes volúmenes de tampón Tris 10 mM a cada reacción para lograr las concentraciones finales ensayadas. Los tubos contenían cebadores dirigidos a los genes N y Orf1ab y se utilizó un control positivo diluido (1000 copias genómicas/reacción) para verificar el efecto del tampón Tris mientras se simulaban muestras de carga viral baja.
Como el sistema Molecular Hilab® no cuenta con una tapa calentada, se produce la evaporación de la solución, lo que puede afectar la eficiencia de la reacción y la adquisición de datos de color. Para evitar este problema, probamos la adición de 0 a 15 μL por reacción de aceite mineral. También probamos si la presencia del aceite mineral podría dificultar de alguna manera la adición de la muestra en la mezcla de reacción, agregando la muestra a través, arriba y en el fondo del aceite, haciendo burbujas intencionalmente en el tubo. Los tubos contenían cebadores dirigidos a los genes N y Orf1ab y se usaron controles positivos como se describió anteriormente.
Para verificar el límite de detección de la reacción RT-LAMP utilizamos controles positivos en concentraciones que oscilan entre 10 y 10.000 equivalentes de genoma por reacción. Cada punto de dilución se realizó en 10 repeticiones técnicas. Los controles se diluyeron en la solución de muestra y las reacciones se llevaron a cabo a 67 °C durante 30 min en el dispositivo Hilab® Molecular como se describió anteriormente. Establecimos el LoD como la dilución máxima donde era posible obtener el 100% de positividad, es decir, amplificación de las dianas.
Para cuantificar los resultados de cada condición optimizada se utilizó un software desarrollado internamente. El software pudo reconocer una hoja de tabla de colores hexadecimales y construir un gráfico basado en el cambio de color de la reacción. Después de construir el gráfico, el operador podía configurar manualmente el tiempo inicial de la amplificación (Xt), por lo que el software eliminaría el fondo y construiría una curva sigmoidea usando una regresión polinomial de 4 parámetros de los datos. El software también devolvió tres parámetros para cada tubo: Nmax, que es el valor delta de la curva de amplificación, TTR, que es el tiempo para alcanzar el 50 % del delta de amplificación, y R, que está relacionado con la eficiencia de la reacción y representa qué tan rápido la reacción alcanza la meseta. También analizamos el tiempo inicial de amplificación (Xt) en algunos casos. Estos parámetros se calcularon para cada prueba que se informa aquí y se usaron para decidir qué condición sería la mejor para cada experimento.
El sistema Molecular Hilab® se utilizó para monitorear las reacciones colorimétricas de forma remota. El dispositivo está compuesto por un termobloque y un sensor RGB, pudiendo inactivar por calor y enfriar las muestras, mantener la reacción a temperatura óptima y detectar la inserción de los tubos de reacción. El operador realiza manualmente la inserción de los tubos en el dispositivo, así como el manejo de la muestra. Los datos de reacción se envían como una serie de tiempo de color. Luego de la recolección de los datos, se generan dos imágenes: una imagen con el cambio gradual del color de la reacción hasta el final de la reacción, y un gráfico construido a partir de la serie de cambios de color, con las curvas de cada tubo a lo largo del tiempo. Con el dispositivo es posible analizar el color de los tubos de reacción con más precisión y robustez que a simple vista, por ejemplo. Estas imágenes junto con el cuestionario de anamnesis se toman en consideración para dar el resultado final de la prueba por profesionales biomédicos en 1 min.
Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente, Raddatz, WB, previa solicitud razonable.
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Bruna Winkert Raddatz, Edson Yu Sin Kim, Louise Matthew Imamura, Gisleine Jarenko Steil, Erika Bergamo James, James Peter Timm Soares, Victor Henrique Alves Ribeiro, Bernardo Montesanti Machado de Almeida, Sergio Renato Rogal Jr. y Marcus Vinicius Mazega Figueredo
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Raddatz, BW, Kim, EYS, Imamura, LM et al. Desarrollo de un RT-LAMP colorimétrico optimizado para el ensayo SARS-CoV-2 con controles de procedimiento mejorados para diagnóstico remoto. Informe científico 12, 21424 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1
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Recibido: 13 Septiembre 2022
Aceptado: 06 diciembre 2022
Publicado: 11 diciembre 2022
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1
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